2. 安徽中医药大学安徽省中医药科学院药物化学研究所, 安徽 合肥 230038
2. College of Pharmacy, Anhui University of Dept of Medicinal Chemistry, Anhui Academy of Chinese Medicine, Hefei 230038, China
脂联素是脂肪组织分泌的一种脂肪细胞因子[1]，为脂联素受体内源性激动剂，可通过结合AdipoR1和AdipoR2，经腺苷酸活化蛋白激酶(AMP-activated protein kinase, AMPK)途径来调节细胞能量利用[2]。研究发现，脂联素可以限制活化的肝星状细胞(hepatic stellate cell, HSC)的增殖和迁移，具有强烈的抗肝纤维化活性[3]。HSC的活化是肝纤维化疾病形成的重要环节，高糖高脂状态对四氯化碳(CCl4)诱导的肝纤维化有促进作用[4]。若可以有效抑制HSC的活化增殖，便能在一定程度上改善肝纤维化状况。CCl4诱导肝纤维化的机制是引起实质炎症和肝细胞坏死，同时产生相关细胞因子，促进HSC的增殖活化等。
有研究报道，天然有机化合物查尔酮类在体外可抑制HSC-T6细胞胶原的合成[5]。AdipoRon为Okada-Iwabu等[6]报道的首个小分子脂联素受体激动剂，课题组前期根据AdipoRon合成了一系列能够改善小鼠肝纤维化的查尔酮化合物。在此基础上，进一步合成两个新的吡啶查尔酮类化合物H7和H8(Fig 1)，研究其对小鼠肝纤维化的作用。
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| Fig 1 Structure of H7 and H8 |
HSC-T6细胞，购自南京凯基生物科技发展有限公司; Balb/c ♂小鼠50只，(18~22) g，购自南京大学模式动物研究所，实验动物许可证号：SYXY(苏)2016-0012。化合物AdipoRon、H7和H8，由本实验室合成。
1.2 方法 1.2.1 实验分组Balb/c小鼠分为5组，每组10只，即正常组、模型组、H7化合物100 mg·kg-1组、H8化合物100 mg·kg-1组、吡非尼酮(Pirfenidone)250 mg·kg-1阳性对照组。正常组与模型组灌胃给予相应溶剂，其余3组灌胃给予相应药物。
1.2.2 CCl4肝纤维化模型的制备和给药方法除空白组外，其余各组动物分别以CCl4腹腔注射造模(CCl4以1 :4比例溶解于橄榄油中，0.5 mL·kg-1)，正常组注射相应的橄榄油溶剂，每周腹腔注射2次，共造模6周。从造模第3周开始各组灌胃给药，空白组给予相应溶剂，每天1次，共给药4周。末次给药后48 h，分别眼眶取血，离心，分离血清，备用。随后迅速剖取肝脏，观察肝脏形态情况，称重，计算肝指数。
1.2.3 指标检测肝指数：脏器指数/%=脏器质量/体质量×100%;肝功能：血清中谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)含量。
1.2.4 MTT法检测H7和H8对HSC-T6细胞增殖的抑制作用取对数生长期的HSC-T6细胞，1×104·L-1接种于96孔板中，于37 ℃、5% CO2条件下培养，加含10%胎牛血清的DMEM培养液孵育24 h，待细胞贴壁后，加入不同浓度的待测化合物溶液(200、100、50、25、12.5、6.25 μmol·L-1)，每个浓度3复孔，阴性组加等体积溶媒，置于CO2恒温培养箱中培养48 h后，加入MTT溶液4 h后，吸去培养液，加入150 μL DMSO，振荡5 min，酶标仪在570 nm处测吸光度值(A)，进行IC50检测。
2 结果 2.1 H7和H8对肝纤维化小鼠转氨酶的影响如Tab 1所示，与正常组比较，模型组小鼠肝指数以及血清中AST和ALT含量明显升高(P＜0.01)，表明肝损伤模型成功建立。给予H7和H8化合物治疗后，小鼠肝指数、血清中AST和ALT较模型组明显降低(P＜0.05，P＜0.01)，与吡非尼酮作用相当，提示H7和H8可抑制AST和ALT的活性。
| Group | Dose/mg · kg-1 | Liver index/% | AST/IU · L-1 | ALT/IU · L-1 |
| Normal | - | 5.62 ±0.49 | 112.53 ±25.66 | 61.06±13.41 |
| Model | - | 6.89 ±0.54* * | 189.62 ±35.71* * | 104.01 ±19.93* * |
| H7 | 100 | 6.24±0.57# | 145.98 ±32.21# | 83.34 ±15.41# |
| H8 | 100 | 6.15 ±0.62# | 129.85 ±30.20# | 81.64 ±15.03# |
| Pirfenidone | 250 | 6.06±0.40## | 123.94 ±18.92## | 74.14 ±20.09## |
| **P＜0.01 vs normal; #P＜0.05, ##P＜0.01 vs model | ||||
由所测得的H7、H8和AdipoRon的IC50值可知，与阳性对照AdipoRon相比，化合物H7和H8对HSC-T6细胞增殖具有明显的抑制作用。H7、H8、AdipoRon的IC50分别为5.627、4.801、32.447 μmol·L-1，提示H7和H8在一定程度上能改善肝纤维化状况。
3 讨论本研究通过制备CCl4诱导的小鼠肝纤维化模型，发现H7和H8可以降低肝纤维化小鼠模型肝指数，以及血清中AST和ALT含量。同时，通过对HSC-T6细胞增殖活性的检测，结果表明H7和H8对HSC-T6细胞增殖具有一定的抑制作用，并且活性优于AdipoRon。提示化合物H7和H8可能具有一定的抑制肝纤维化活性，但化合物是否具有良好的改善CCl4诱导的小鼠肝纤维化作用，有待进一步机制研究。
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