2. 延边大学医学院病理学教研室，吉林 延吉 133002;
3. 延边大学吉林省科技厅重点实验室，吉林 延吉 133002;
4. 大连医科大学附属第一医院病理科，辽宁 大连 116011;
5. 延边大学附属医院神经内科，吉林 延吉 133000
2. Dept of Pathology, Medical College, Yanbian University, Yanji Jilin 133002, China;
3. Key Lab of the Science and Technology Dept of Jilin Province, Yanbian University, Yanji Jilin 133002, China;
4. Dept of Pathology, the First Affiliated Hospital of Dalian Medical University, Dalian Liaoning 116011, China;
5. Dept of Neurology, Affiliated Hospital of Yanbian University, Yanji Jilin 133000, China
我国是原发性肝癌(hepatocellular carcinoma，HCC)大国，全球每年约一半新发病例出现在我国。近几年，虽然分子靶向治疗肝癌取得了一定的效果，但局部扩散和远端转移仍是肝癌患者死亡的主要原因。因此，寻找可以有效抑制肝癌细胞转移的分子靶向药物刻不容缓。上皮-间质转化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)是肿瘤转移的重要机制。而PI3K/Akt/mTOR通路是细胞重要的信号转导通路之一，与肿瘤的蛋白合成、生长代谢、迁移浸润以及血管生成密切相关。研究显示，PI3K/Akt/mTOR通路可通过直接诱导、上调核转录因子表达等方式，诱导EMT的发生。同时，Six1作为Ezrin的上游调节因子，可激活TGF-β信号通路，从而促进EMT相关基因的表达。
NVP-BEZ235(以下简称为BEZ235，结构见Fig 1A)是PI3K和mTOR的双重靶点抑制剂，可抑制乳腺癌[1]、前列腺癌[2]、胃癌[3]、结直肠癌[4]、神经母细胞瘤[5]等多种肿瘤的恶性进展。目前，虽有文献报道BEZ235可抑制肝癌的增殖和侵袭，但其作用机制仍不清楚[6]。因此，本研究旨在检测BEZ235对肝癌细胞HepG2增殖和迁移的影响，并探讨其可能的分子机制。
1 材料与方法 1.1 材料 1.1.1 细胞株人肝癌细胞株HepG2，购自美国模式培养物保藏所(American Type Culture Collection)。
1.1.2 试剂胎牛血清、DMEM培养基、青霉素/链霉素、胰蛋白酶等试剂，均购自美国Gibco公司; 磷酸盐缓冲溶液(phosphate buffer saline，PBS)，购自北京中杉金桥生物技术有限公司; 二甲基亚砜(dimethyl sulfoxide，DMSO)、Hoechst 33342荧光染料、MTT，均购自北京索莱宝生物科技有限公司; RIPA裂解液、BCA蛋白定量试剂盒，均购自北京康为世纪生物科技有限公司; BEZ235购自美国Sigma Aldrich公司; p-mTORSer2448、mTOR、p-AktSer473、Akt、p-S6Thr389、S6、p-4E-BP1Thr37/46、4E-BP1、E-cadherin、Vimentin、Snail、Six1、p-EzrinTyr353、Ezrin等抗体，均购自美国Cell Signaling Techology公司; β-actin、HRP标记的二抗，均购自北京中杉金桥生物技术有限公司; 荧光二抗Alexa Fluor® 488、Alexa Fluor® 568，均购自美国Thermo Fisher Scientific公司。
1.1.3 仪器CO2恒温培养箱(新加坡ESCO公司); 全波长多功能酶标仪(瑞士Tecan公司); 光学倒置显微镜(日本Olympus公司); 台式高速离心机(美国Thermo公司); ChemiDoc成像系统(美国Bio-Rad公司); 共聚焦显微镜(德国Leica公司)。
1.2 方法 1.2.1 细胞培养将HepG2细胞置于含10%胎牛血清、1%青霉素/链霉素的DMEM培养基中，在37 ℃、5% CO2的培养箱中培养。
1.2.2 MTT实验将HepG2细胞以每孔100 μL(5×103个细胞)接种于96孔板。次日，加入BEZ235(0、25、50、100、250、500 nmol·L-1)继续培养48 h，每个浓度设5个平行复孔。每孔加入5 g·L-1 MTT溶液20 μL，继续培养4 h后，弃上清，加入DMSO，震荡，用全波长酶标仪于490 nm波长测定吸光值。根据公式计算细胞生存率：细胞生存率=用药组吸光值/对照组吸光值×100%。
1.2.3 细胞形态学观察通过倒置显微镜观察BEZ235对HepG2细胞形态学的影响。
1.2.4 Hoechst 33342染色在6孔板中放置预先灭菌处理好的盖玻片并接种细胞，各组细胞BEZ235处理48 h后，用10 mg·L-1 Hoechst 33342染液于培养箱内避光孵育15 min，经固定、洗涤、封片后，在荧光显微镜下拍照。
1.2.5 划痕愈合实验将细胞等量接种于6孔板中，待细胞的融合度达到90%时，用200 μL枪头划痕。加入BEZ235/DMEM培养基，分别处理0、24、48 h后观察、拍照。测量划痕间距，根据公式计算划痕愈合率：划痕愈合率/%=(0 h划痕宽度-24/48 h划痕宽度)/0 h划痕宽度×100%。
1.2.6 Transwell迁移实验将HepG2细胞消化、离心，并以100 μL(5×104个细胞)接种于Transwell上室。细胞贴壁后，上室分别加入BEZ235/DMEM培养基(无血清)，下室加入含10%血清的DMEM培养基。于37 ℃、5% CO2的培养箱中培养24 h后终止培养，依次进行固定、结晶紫染色、脱色、擦去上室细胞、取膜、封片后，于显微镜下观察、拍照。
1.2.7 Western blot检测HepG2经不同浓度BEZ235处理48 h后，收集各组细胞，用RIPA裂解液提取总蛋白，BCA蛋白定量试剂盒测定蛋白浓度。取40 μg蛋白依次进行SDS-PAGE凝胶电泳、转膜、5%脱脂牛奶封闭后，一抗(1 :1 000)4 ℃孵育过夜。次日，洗膜，二抗(1 :3 000)室温孵育2 h后，ECL法显影、曝光。以β-actin为内参，评价各目的蛋白的相对表达水平。
1.2.8 免疫荧光染色在6孔板中放置灭菌处理好的盖玻片并接种细胞，各组细胞经BEZ235处理48 h后，依次进行多聚甲醛固定、Triton X-100透化、牛血清封闭后，一抗(1 :500)4 ℃孵育过夜。次日，洗涤，荧光二抗(1 :400)室温避光孵育2 h。洗涤后，DAPI染色，封片，于荧光显微镜下拍照。
1.2.9 GeneMANIA数据库分析登陆GeneMANIA在线数据库(http://www.genemania.org)，选择人类种属Homo Sapiens，输入Six1、Ezrin以及PI3K/Akt/mTOR信号通路的相关基因，确认信息后即可显示分析结果。
1.2.10 统计学分析采用SPSS 17.0统计软件进行数据分析，实验数据以x±s表示，组间比较采用单因素方差分析。每组实验均重复3次以上。
2 结果 2.1 BEZ235抑制HepG2细胞增殖Fig 1B的MTT结果显示，BEZ235(0、25、50、100、250、500 nmol·L-1)处理HepG2细胞48 h后，细胞的增殖活性随着用药浓度的升高逐渐降低，且呈浓度依赖性(P＜0.05)。根据MTT结果，BEZ235(0、50、100、250 nmol·L-1)作为后续实验的用药浓度。通过倒置显微镜观察细胞形态发现(Fig 1C)，对照组细胞增殖旺盛、单个细胞胞体饱满且呈密集分布; 而梯度用药组随着BEZ235浓度的升高，其细胞密度逐渐降低、细胞间隙逐渐增大、核内颗粒也逐渐增多，进一步表明BEZ235明显抑制HepG2细胞的增殖。
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| Fig 1 Effect of BEZ235 treatment on proliferation of HepG2 cell in vitro A: The molecular structure of BEZ235; B:Cell viability of HepG2 cells treated by BEZ235 was measured by MTT assay(x±s, n=3); C: Phase-contrast photomicrographs displayed the morphology of BEZ235-treated HepG2 cells(×200).*P < 0.05, **P < 0.01 vs control group. |
Hoechst 33342染色发现(Fig 2)，与对照组相比，BEZ235组细胞出现了明显的核固缩和亮蓝染色的凋亡小体，提示BEZ235可诱导HepG2细胞发生凋亡。
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| Fig 2 Apoptosis of HepG2 cells exacerbatedby BEZ235 by Hoechst 33342 staining(×400) White arrowhead identifies apoptotic nuclei. A:Control group; B:BEZ235(100 nmol·L-1)-treated group. |
Fig 3的划痕愈合实验和Transwell迁移实验结果显示，与对照组相比，用药组细胞的横向和纵向迁移能力明显受到抑制，且差异具有统计学意义(P＜0.01)，提示BEZ235可抑制肝癌细胞的横向和纵向迁移能力。
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| Fig 3 Influence of BEZ235 on migration of HepG2 cells determined by scratch wound-healing assay and Transwell assay(x±s, n=3) A: Scratch wound-healing assay(×100); B: Quantification of results; C: Transwell assay(×200); D: Quantification of results.*P < 0.05, **P < 0.01 vs control group. |
Fig 4的Western blot结果显示，与对照组相比，用药组p-AktSer473、p-S6Thr389和p-4E-BP1Thr37/46的蛋白表达水平随着药物浓度的升高明显下调(P＜0.01)。提示BEZ235抑制HepG2细胞的增殖、迁移与Akt、S6以及4E-BP1的磷酸化水平降低有关。
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| Fig 4 Activation of PI3K/mTOR pathway inhibitedby BEZ235 in HepG2 cells(x±s, n=3) **P < 0.01 vs control group |
为了检测BEZ235对EMT进程的影响，Western blot检测EMT相关蛋白的表达水平。结果显示(Fig 5A)，与对照组相比，BEZ235组上皮标志物E-cadherin表达上调，间质标志物Vimentin、Snail表达下调，且呈浓度依赖性(P＜0.05)。免疫荧光结果显示(Fig 5B)，BEZ235可上调E-cadherin的表达，下调Vimentin的表达，提示BEZ235可明显抑制肝癌细胞的EMT进程。
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| Fig 5 EMT progression of HepG2 cells suppressed by BEZ235 A: Expression of E-cadherin, Vimentin and Snail was detected in BEZ235-treated HepG2 cells by Western blot(x±s, n=3); B: Expression of E-cadherin and Vimentin in BEZ235-treated-HepG2 cells was detected by immunofluorescence staining(×400).*P < 0.05, **P < 0.01 vs control group. |
GeneMANIA数据库分析结果显示(Fig 6A)，PI3K/Akt/mTOR信号通路与Six1和Ezrin具有相关性。同时，本课题组前期研究发现，Six1和Ezrin在肝癌患者中过表达，且与患者的TNM分期和转移密切相关[7]。因此，进一步通过Western blot实验检测BEZ235是否对Six1和Ezrin产生影响。结果显示(Fig 6B)，与对照组相比，BEZ235组Six1和p-EzrinTyr353的蛋白表达水平明显下调，且呈浓度依赖性(P＜0.05)，提示Six1/Ezrin信号轴参与了BEZ235对HepG2细胞增殖和迁移的调控。
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| Fig 6 Six1 and p-Ezrin protein expression of HepG2 cells suppressed by BEZ235 A: Network of PI3K/Akt/mTOR-Six1/Ezrin interactions; B: Expression of Six1, p-Ezrin and Ezrin was detected in BEZ235-treated HepG2 cells by Western blot(x±s, n=3).*P < 0.05, **P < 0.01 vs control group. |
研究显示，单纯针对PI3K的抑制剂，如LY294002，虽可抑制肿瘤细胞增殖、诱导凋亡的发生，但存在药物疗效差、潜在毒性强等缺点; 而单纯针对mTOR的抑制剂，如RAD001，则可负反馈激活PI3K，导致细胞出现耐药性[8-9]。本研究中使用的BEZ235是PI3K/mTOR的双靶点抑制剂，可竞争性结合ATP，影响PI3K/mTOR通路的下游分子[10]，从而抑制肿瘤的发生、发展。
在实验中，我们通过MTT实验检测BEZ235对HepG2肝癌细胞增殖活性的影响。结果显示，BEZ235可以明显抑制HepG2细胞的增殖活性，且呈现浓度依赖性。进一步的形态学观察结果显示，BEZ235可明显减少HepG2细胞的增殖数量，提示BEZ235可以从细胞活性和细胞数量两个方面对HepG2细胞的增殖产生抑制作用。这一结果与李良庆等[3]的研究结果相一致。Chang等[11]研究显示，BEZ235可通过诱导凋亡而抑制肝癌细胞Hep3B的增殖。在本研究中，Hoechst 33342染色结果提示，BEZ235可诱导HepG2细胞凋亡，从而抑制细胞增殖。在迁移方面，划痕愈合实验和Transwell迁移实验结果显示，BEZ235可明显抑制HepG2细胞的迁移。这一结果与魏娟等[6]的研究结果一致。
大量研究显示，PI3K的下游分子Akt的磷酸化水平可调控肿瘤细胞的凋亡，而mTOR的下游分子S6和4E-BP1的磷酸化水平可影响肿瘤细胞的增殖和迁移[12]。我们的结果显示，BEZ235组p-AktSer473、p-S6Thr389和p-4E-BP1Thr37/46的蛋白表达水平均受到明显抑制，提示BEZ235可通过抑制Akt、S6和4E-BP1的磷酸化，调控HepG2细胞的凋亡、增殖和迁移。EMT在肿瘤细胞的迁移和浸润过程中发挥重要作用。在EMT的进程中，上皮标志物(如E-cadherin、ZO-1等)表达下调，间质标志物(如Vimentin、N-cadherin、Snail、Slug、Twist等)表达上调，可诱导细胞骨架重构，使原先紧密连接的细胞变得松散、黏附力下降，更易于从原发部位脱落，从而增强肿瘤细胞的运动和侵袭性。本课题组前期的研究结果显示，BEZ235可通过上调E-cadherin、ZO-1的表达，下调Vimentin、Twist的表达，逆转非小细胞肺癌的EMT进程[13]。本实验采用Western blot和免疫荧光实验，检测了BEZ235对HepG2细胞EMT相关标志物的影响。结果显示，与对照组相比，BEZ235组E-cadherin表达明显上调，Vimentin和Snail表达明显下调，提示BEZ235可通过逆转EMT进程，抑制HepG2细胞的迁移。Yu等[14]研究显示，Six1/Ezrin在肿瘤的转移中发挥着重要的作用。本课题组前期的研究证实，Six1和Ezrin在肝癌患者中过表达，且与患者的TNM分期和转移密切相关[7]。通过GeneMANIA数据库发现，Six1/Ezrin与PI3K/Akt/mTOR信号通路存在交互关系。Gautreau等[15]的研究也显示，p-EzrinTyr353可直接作用于p85，进而激活PI3K/Akt信号通路，调控肿瘤细胞的增殖和转移。因此，我们采用Western blot检测了BEZ235对Six1/Ezrin表达的影响。结果显示，BEZ235可下调Six1和p-EzrinTyr353的蛋白表达。提示Six1/Ezrin信号轴参与了BEZ235对HepG2细胞增殖和迁移的调控。
综上所述，NVP-BEZ235可有效抑制HepG2细胞的增殖和迁移，其机制可能与NVP-BEZ235降低p-AktSer473、p-S6Thr389、p-4E-BP1Thr37/46的表达，抑制Six1/Ezrin信号轴以及逆转EMT的进程有关。
( 致谢: 本实验是在吉林省科技厅重点实验室、延边大学肿瘤研究中心分子病理实验室完成，感谢实验室各位老师的指导与帮助。)
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