间充质干细胞(mesenchymal stem cells，MSCs)具有多向分化潜能，在适当因子诱导下可分化为脂肪细胞、软骨细胞、肌细胞、成骨细胞等，是再生领域中较为理想的种子细胞。深入了解MSCs骨向分化的调控机制，有助于推动组织工程骨发展和提高相关骨疾病的治疗效果。
骨形态蛋白(bone morphogenetic proteins，BMPs)属于转化生长因子β(transforming growth factor β，TGF-β)超家族, 在人类目前发现20余种BMP成员，除对骨的发育和修复有重要作用外，还参与其他生理或病理过程。BMP2和BMP7已被美国食品药品管理局批准用于治疗相关骨科疾病，如骨折和骨不连[1]。课题组前期研究表明，BMP9诱导MSCs骨向分化作用明显强于其他BMPs成员[2]。文献报道，BMP9诱导MSCs成骨分化可能与成纤维细胞生长因子2(fibroblast growth factor 2，FGF2)、胰岛素样生长因子(insulin-like growth factors，IGFs)、生长激素(growth hormone，GH)、环氧合酶2(cyclooxygenase 2，COX-2)和维甲酸信号有关[3]，但其诱导MSCs骨向分化的详细机制目前仍不清楚。
Wnt信号对细胞的增殖与分化具有重要调控作用, 该信号依据是否需要β-catenin参与介导，可分成经典Wnt信号(即Wnt/β-catenin信号)和非经典Wnt信号。文献报道，Wnt信号与多种骨骼系统疾病有关，如骨质疏松症、假性胶质瘤综合征等。文献报道，Wnt/β-catenin信号失活，会抑制成骨细胞的活性和骨吸收，并最终导致骨质减少[4]。课题组前期研究表明，BMP9在诱导MSCs骨向分化的过程中能明显增强Wnt/β-catenin信号活性，抑制该信号则减弱BMP9的成骨分化诱导能力。然而，关于BMP9诱导MSCs骨向分化与非经典Wnt通路之间的关系尚不清楚。Wnt11是一种非经典Wnt蛋白，也参与骨骼系统发育的调控。研究表明，Wnt11可能与高骨量综合征有关，外源性Wnt11可增强干细胞的成骨能力[5]。同时，Wnt11在牙髓中也有表达且能促进成牙细胞分化[6]。目前尚不清楚BMP9诱导MSCs骨向分化是否与Wnt11有关，本研究主要分析BMP9诱导MSCs成骨分化与Wnt11的关系，以及可能分子机制。
1 材料与方法 1.1 材料 1.1.1 细胞株小鼠间充质干细胞C3H10T1/2、小鼠胚胎成纤维细胞(mouse embryonic fibroblasts，MEFs)、小鼠肌源性干细胞C2C12、小鼠成骨前体细胞MC3T3-E1，均购自美国ATCC(American Type Culture Collection)。细胞培养条件为37 ℃、5% CO2，采用含10%胎牛血清、100 kU·L-1青霉素及0.1 g·L-1链霉素的高糖DMEM培养间充质干细胞。
1.1.2 试剂实验所用一抗，均购自Santa Cruz Biotechnology公司; COX-2的抑制剂NS-398(N194-25MG)，购自Sigma-Aldrich公司; p38 MAPK抑制剂SB203580(s1076)，购自赛力克(Selleck)，二者均采用DMSO作为溶媒; 碱性磷酸酶(alkaline phosphatase，ALP)试剂盒(C3206)，购自碧云天生物技术公司。
1.1.3 仪器CO2细胞培养箱、高速低温离心机(美国Thermo公司); 倒置荧光显微镜(日本Nikon公司); 定量PCR仪(美国Bio-Rad公司); 垂直电泳槽及湿式转膜仪(北京六一仪器厂)。
1.2 BMP9和Wnt11重组腺病毒载体的构建本研究所用的重组腺病毒载体采用AdEasy系统构建。即对鼠源BMP9和Wnt11，以及绿色荧光蛋白(GFP)的编码序列进行扩增，然后将所获片段克隆到穿梭载体, 线性化穿梭载体并在BJ5183/Adeasy细胞中进行重组; 最后，把重组的质粒线性化，转染到HEK293细胞中进行重组腺病毒包装。所获重组腺病毒命名为AdBMP9、AdWnt11和AdGFP，其中AdGFP作为重组腺病毒对照。
1.3 RNA提取及聚合酶链反应采用TRIzol试剂提取总RNA，然后通过逆转录反应获得cDNA。将所得到的cDNA稀释5~10倍后，作为PCR分析的模板。本实验所用PCR引物序列为：GAPDH上游引物5′-CAACGAATTTGGCTACAGCA-3′，下游引物5′-AGGGGAGATTCAGTGTGGTG-3′; Wnt11上游引物5′-ACCCCTACACGGACAGAGTG-3′, 下游引物5′-AGGGAAGTCCACCAAGGTCT-3′。GAPDH作为内参，每组实验重复3次。
1.4 Western blot实验将生长状态良好的C3H10T1/2细胞种于6孔板，待细胞贴壁后，根据实验设计加入相应的处理因素。于设定的时间点将细胞裂解，并将裂解液煮10 min变性，采用BCA法测定样品总蛋白浓度。采用常规方法进行Western blot实验。最后利用化学发光试剂(ECL)显影并采集图像，每组实验重复3次。
1.5 ALP活性测定将指数生长细胞接种到24孔板，待贴壁后按实验设计加入相应的处理因素。分别于处理后d 5、7检测ALP活性，具体操作按试剂盒的说明进行。将染色结果进行扫描或在显微镜下拍照，每组实验重复3次。
1.6 茜素红S染色将C3H10T1/2细胞铺于24孔培养板上，并根据实验设计进行处理。于处理后d 20，使用茜素红S染色检测矿化情况。操作步骤简述如下：弃培养基后用PBS洗3次，加入2.5%戊二醛固定20 min; 弃戊二醛后，用pH 4.2的PBS洗1次，然后用茜素红工作液孵育30 min。最后，弃染液，并用双蒸水清洗即可。将染色结果进行扫描或在显微镜下拍照，每组实验重复3次。
1.7 荧光素酶报告质粒检测将生长良好的细胞种于T25培养瓶中，贴壁后，用Lipofectamine 2000转染2 μg报告质粒(p12×SBE-Luc)。转染16 h后，将细胞消化并接种到24孔板中，并分别用AdGFP、AdBMP9、AdWnt11以及AdBMP9和AdWnt11处理。24 h后，将细胞裂解并按照试剂盒说明书测定报告质粒的转录活性。用BCA法测定蛋白浓度，并用总蛋白质标准化荧光素酶活性，每组实验重复3次。
1.8 统计学分析采用SPSS 20.0软件处理数据，单因素方差分析用于评价组间差异。所有数据均以x±s来表示。
2 结果 2.1 BMP9对C3H10T1/2细胞成骨分化的影响ALP染色结果显示，BMP9能明显增加C3H10T1/2细胞中ALP的活性(Fig 1A)。Western blot分析结果显示，BMP9能增加C3H10T1/2细胞中骨桥蛋白(osteopontin，OPN)的表达水平(Fig 1B)。同时，BMP9还能在C3H10T1/2细胞中明显诱导钙盐沉积(矿化)(Fig 1C)。以上实验结果表明，BMP9具有明显诱导MSCs骨向分化的潜能。
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| Fig 1 Effects of BMP9 on osteogenic differentiation in C3H10T1/2 cells A: ALP staining results showed the effect of BMP9 on ALP activities in C3H10T1/2 cell concentration dependently; B: Western blot assay results showed the effect of BMP9 on OPN in C3H10T1/2 cells; C: Alizarin Red S staining results showed the effect of BMP9 on matrix mineralization in C3H10T1/2 cell concentration dependently. |
定量PCR测定结果显示，Wnt11在C3H10T1/2、MEFs、MC3T3-E1和C2C12等细胞中均有内源性表达(Fig 2A)。在C3H10T1/2细胞中，BMP9可以明显促进Wnt11的mRNA及蛋白表达(Fig 2B、2C)。以上结果表明，BMP9在MSCs中能诱导Wnt11表达，提示Wnt11可能参与调节BMP9诱导的MSCs成骨分化。
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| Fig 2 Effects of BMP9 on expression of Wnt11in multipotential progenitor cells A: Real-time PCR assay results showed the endogenous expression of Wnt11 in the available progenitor cells; B: PCR assay results showed the effect of BMP9 on Wnt11 in C3H10T1/2 cells; C:Western blot assay results showed the effect of BMP9 on Wnt11 in C3H10T1/2(24 h); D: Western blot assay results showed the effect of Wnt11 recombinant adenovirus on Wnt11 in C3H10T1/2 cells(24 h). |
ALP染色结果显示，Wnt11对C3H10T1/2细胞的ALP活性没有影响，但可明显增加BMP9诱导C3H10T1/2细胞ALP活性增加的作用(Fig 3A)。Western blot分析结果显示，Wnt11对OPN的蛋白水平无明显影响，但可增强BMP9在C3H10T1/2细胞中促进OPN表达的作用(Fig 3B)。茜素红染色结果显示，Wnt11本身并不能在C3H10T1/2细胞中诱导矿化，但可促进BMP9诱导C3H10T1/2细胞矿化的作用(Fig 3C)。以上结果提示，Wnt11能促进BMP9诱导C3H10T1/2细胞骨向分化的作用。
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| Fig 3 Effects of Wnt11 on osteogenic markers induced by BMP9 in C3H10T1/2 cells A: ALP staining results showed the effect of BMP9 and/or Wnt11 on ALP activities in C3H10T1/2 cells; B: Western blot assay results showed the effect of BMP9 and/or Wnt11 on OPN in C3H10T1/2 cells; C: Alizarin Red S staining results showed the effect of BMP9 and/or Wnt11 on matrix mineralization in C3H10T1/2 cells. |
报告质粒分析结果显示，BMP9增加p12xSBE-Luc报告质粒的转录活性。虽然Wnt11对该报告质粒的转录活性没有明显影响，但能明显增强BMP9对该报告质粒转录活性的促进作用(Fig 4A)。Western blot分析结果显示，BMP9能促进Smad1/5/8的磷酸化(p-Smad1/5/8)，同时也增加Smad1/5/8的总蛋白水平; Wnt11对Smad1/5/8和p-Smad1/5/8的水平均无明显影响，但能明显增强BMP9对Smad1/5/8磷酸化的促进作用(Fig 4B~4D)。以上实验结果提示，Wnt11对BMP9诱导MSCs成骨分化的促进作用可能与其增强BMP/Smad信号转导有关。
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| Fig 4 Effects of Wnt11 on BMPs/Smads signal induced by BMP9 in C3H10T1/2 cells A: Luciferase reporter assay results showed that the effect of Wnt11 on the BMPs/Smads signal activity increased by BMP9 in C3H10T1/2 cells; B: Western blot assay results showed the effect of Wnt11 on Smad1/5/8 and p-Smad1/5/8 affected by BMP9 in C3H10T1/2 cells; C: Quantification of the result of Western blot assay showed the effect of Wnt11 on Smad1/5/8 affected by BMP9 in C3H10T1/2 cells; D: Quantification of the result of Western blot assay showed the effect of Wnt11 on p-Smad1/5/8 affected by BMP9 in C3H10T1/2 cells.*P<0.05, **P<0.01 vs AdGFP; #P<0.05, ##P<0.01 vs AdBMP9 group. |
Western blot检测结果显示，BMP9或Wnt11均能促进p38 MAPK磷酸化(p-p38)，且Wnt11能明显增强BMP9促进p38 MAPK磷酸化的作用(Fig 5A)。Wnt11可促进BMP9诱导C3H10T1/2细胞ALP活性增强的作用，抑制p38 MAPK能明显减弱BMP9诱导ALP活性增加的作用，但Wnt11能明显逆转p38 MAPK抑制剂对BMP9诱导ALP活性的抑制作用(Fig 5B)。Western blot分析结果显示，Wnt11增加BMP9诱导的OPN蛋白水平，但可被p38 MAPK的抑制剂减弱; 当与Wnt11合用时，p38 MAPK抑制剂降低BMP9诱导OPN蛋白表达作用可被明显逆转(Fig 5C)。Wnt11可以促进BMP9诱导C3H10T1/2细胞矿化，p38 MAPK特异性抑制剂明显降低BMP9诱导矿化的作用; 但是，p38 MAPK抑制剂对BMP9诱导矿化的抑制作用可明显被外源Wnt11逆转(Fig 5D)。以上实验结果提示，Wnt11对BMP9诱导MSCs成骨分化的促进作用可能也与其增强p38 MAPK信号转导有关。
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| Fig 5 Effects of p38 MAPK and Wnt11 on BMP9-induced osteogenic differentiation in C3H10T1/2 cells A: Western blot assay results showed the effect of BMP9 and/or Wnt11 on p38 and p-p38 in C3H10T1/2 cells; B: ALP staining results showed the effects of BMP9, Wnt11, and/or p38 on ALP activities in C3H10T1/2 cells(SB: SB203580, p38 MAPK-specific inhibitor); C: Western blot assay results showed the effects of BMP9, Wnt11, and/or p38 on OPN in C3H10T1/2 cells(Day 11); D: Alizarin Red S staining results showed the effects of BMP9, Wnt11, and/or p38 on matrix mineralization in C3H10T1/2 cells. |
BMP9具有明显诱导干细胞骨向分化的能力，但该作用的分子机制目前仍不十分清楚。本研究发现，BMP9在MSCs中能明显上调Wnt11表达水平，而Wnt11对BMP9诱导C3H10T1/2细胞骨向分化的功能具有促进作用; Wnt11促进BMP9诱导MSCs骨向分化的作用可能与增强BMP/Smad信号及p38 MAPK信号转导有关，但具体机制仍需进一步深入研究。
BMP9具有更强的成骨分化诱导作用，具有较好的临床应用前景。但迄今为止，BMP9诱导干细胞骨向分化的机制仍不十分清楚。Wnt信号能调控细胞的增殖与分化，因而对胚胎和个体的发育具有重要影响。文献报道，Wnt3a可诱导脂肪组织来源祖细胞的成骨分化，但它只是增加早期成骨分化[7]。Wnt/β-catenin信号可促进成骨细胞分化过程中BMP2的表达[8]。骨硬化蛋白是Wnt/β-catenin信号的内源性抑制因子，抑制骨硬化蛋白可以增加骨量[9]。课题组前期研究表明，BMP9可以激活Wnt/β-catenin信号，沉默β-catenin可减弱BMP9诱导干细胞成骨分化的能力。除经典Wnt信号外，非经典Wnt信号对成骨分化也具有调控作用。Wnt5a是非经典Wnt蛋白，能调节骨重建过程，并促进MSCs的成骨分化[10-11]。Wnt11也是一种非经典途径的Wnt蛋白，在人类早期胚胎中，Wnt11的表达局限于发育中骨骼的软骨膜和其他特殊区域，如肺间质和输尿管芽。Wnt11位于为11q13.5，提示Wnt11可能与高骨密度有关[12]。在MSCs成骨过程中，Wnt11能被上调，且能增加成骨能力[5]，Wnt11可以调节拉伸应力，诱导脂肪来源的MSCs成骨分化[13]。本研究结果显示，BMP9能促进Wnt11表达，过表达Wnt11能促进BMP9诱导C3H10T1/2细胞向成骨细胞分化的能力。
BMP9可通过BMP/Smad信号发挥其生理功能。即BMP9与Ⅱ型BMP受体结合，然后与Ⅰ型受体形成异二聚体并激活Ⅰ型受体。这种异二聚体促进Smad1/5/8磷酸化，然后磷酸化的Smad1/5/8与Smad4形成复合物，并易位入核，调节下游靶基因表达。因此，Wnt11对BMP9诱导MSCs成骨分化的促进作用可能与该信号的转导活性增加有关。本研究结果显示，尽管过表达Wnt11本身对Smad1/5/8的磷酸化水平没有明显影响，但Wnt11可以增强BMP9促进Smad1/5/8磷酸化的作用。此外，BMP9也可通过非经典BMP/Smad信号发挥其功能，如MAPKs[14]。文献报道，抑制p38 MAPK可减少Wnt11在人主动脉瓣膜间质细胞中诱导的钙化[15]。因此，我们推测Wnt11也可能通过p38 MAPK途径增强BMP9诱导的成骨分化。本研究结果显示，BMP9和Wnt11均可促进p38 MAPK的磷酸化，抑制p38 MAPK则减弱BMP9的成骨分化诱导能力，但这一作用能被Wnt11明显逆转。提示Wnt11促进BMP9诱导MSCs成骨分化的作用可能与增强p38 MAPK信号有关。
本研究结果表明，BMP9在MSCs中可以上调Wnt11表达，并且Wnt11可以增强BMP9的成骨分化诱导能力，这种作用可能与Wnt11增强BMP9诱导的BMP/Smad和p38 MAPK信号转导活性有关。研究结果可能有助于促进基于BMP9的骨组织工程发展，但Wnt11调节BMP/Smad和p38 MAPK信号的机制还需进一步研究。
( 致谢: 本实验在重庆市生物化学与分子药理学重点实验室完成。感谢何通川教授(T. C. HE，芝加哥大学医学中心)馈赠本实验所需的重组腺病毒载体。)
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