2. 广州医科大学附属第五医院检验科，广东 广州 510000
2. Dept of Clinical Lab, the Fifth Affiliated Hospital of Guangzhou Medical University, Guangzhou 510000, China
随着人民生活水平的不断提高，我国糖尿病患者迅速增多，至2016年，糖尿病的全年患病率从3.7%上升到6.6%，并且所有年龄段的糖尿病和糖尿病相关的死亡率分别增加了63.5%和33.3%，糖尿病对于我国人民的威胁已到了不可忽视的地步[1]。糖尿病性心肌病(diabetic cardiomyopathy，DCM)是糖尿病性心脏病的特异性病变，是独立于高血压、冠状动脉疾病的常见糖尿病并发症，其发病机制非常复杂，迄今为止的研究和报道仍未完全阐明。因此，阐明DCM的发病机制，建立有效的治疗方法和手段具有十分重要的意义。
经典的Wnt/β-catenin信号通路作为一条保守的信号传导通路，广泛存在于各生物体中，参与调控细胞增殖、迁移、分化等细胞发育过程[2]。该信号通路的异常调节与各种心脏疾病状况有关，在心脏发育、心肌肥厚、心力衰竭等生理和病理生理进程中起重要作用[3]。TCF7L2作为T细胞因子/淋巴细胞增强子结合因子(T cell factor/lymphocyte enhancer factor，TCF/LEF)家族成员，是经典Wnt/β-catenin信号通路的下游核转录因子之一，参与细胞增殖、分化的调节[4-5]。近来研究发现，TCF7L2基因多态性与糖尿病存在明显关联。TCF7L2参与调节胰岛β细胞分泌功能、细胞增殖与凋亡[6-7]；并能调控肝脏糖、脂代谢基因的表达，参与能量代谢稳态调节；特异性敲除肝脏TCF7L2能提高胰岛素敏感性，改善糖耐量，降低肝糖合成[8]。此外，在β-catenin的作用下，TCF7L2与LEF共同调节胰高血糖素原基因的表达，以及胰高血糖素样肽-1(glucagon like peptid-1，GLP-1)的分泌，从而调节机体血糖稳态。但是在糖尿病心脏中，β-catenin/TCF7L2通路的具体作用，目前尚不完全清楚。因此，本研究以C57BL/6小鼠为主要对象，通过腹腔注射链脲佐菌素(streptozocin，STZ)建立1型糖尿病(diabetic mellitus，DM)模型, 明确β-catenin/TCF7L2通路对心肌肥大标志基因心房钠尿肽前体A基因(natriuretic peptide precursor A，Nppa)以及DCM发生、发展中的作用及机制。
1 材料 1.1 实验动物SPF级C57BL/6 ♂小鼠，7~8周龄，体质量(20±4) g，由广州中医药大学实验动物中心提供，生产许可证：SCXK(粤)2013-0034。饲养环境模拟自然昼夜条件，温度(22±3)℃，湿度40%~45%，自由饮水。
1.2 药物与试剂β-catenin转录抑制剂14(inhibitors of β-catenin responsive transcription 14，iCRT14)(MCE公司，批号677331-12-3)；STZ(Sigma公司)；RIPA裂解液(Cell Signaling Technology公司)；蛋白酶与磷酸酶抑制剂(Selleck公司)；TCF7L2、β-catenin、活化的β-catenin、GAPDH抗体(Cell Signaling Technology公司)；TRIzol(Ambion公司); BCA蛋白试剂盒(Thermo Fisher公司)。
1.3 仪器MDF-381AT型-70 ℃低温冰箱(日本三洋)；电子血糖仪(美国SD BIOSENSOR); 低温高速离心机(德国Hettich)；StepOnePlus Real-Time PCR仪(Applied Biosystems公司)；凝胶电泳仪、电泳槽(Bio-Rad公司)。
2 方法 2.1 动物造模与分组7~8周龄C57BL/6小鼠腹腔注射用柠檬酸缓冲液配好的STZ 45 mg·kg-1·d-1，连续注射6 d。正常组给予等量的柠檬酸缓冲液。注射结束3 d后，测量小鼠随机血糖，血糖浓度高于1.67×10-2 mol·L-1的小鼠视为造模成功。DM成模4周后，将血糖稳定的小鼠随机分, 4组：正常对照组(control，CON)、糖尿病模型组(DM)、iCRT14低、高浓度组(2.5、5.0 mg·kg-1)，每组8~10只小鼠。隔天腹腔注射药物1次，连续给药8周。给药期间，正常饮食，自由饮水。
2.2 HE染色各组小鼠麻醉后，摘取心脏，并用PBS洗净残留血液，用4%多聚甲醛浸泡24 h后，脱水浸蜡，制作石蜡切片，切片用苏木精和伊红染色，光镜显微镜下观察分析心肌组织病理学变化。
2.3 免疫组化检测TCF7L2和β-catenin蛋白在细胞中的分布将石蜡切片脱蜡至水后，用柠檬酸抗原修复缓冲液修复抗原。3% BSA均匀覆盖组织，室温封闭30 min，加入一抗4 ℃孵育过夜，同属性二抗室温孵育50 min，DAB显色、苏木精复染细胞核后，脱水封片。
2.4 Western blot检测TCF7L2和β-catenin蛋白表达取各组小鼠左心组织，制备组织匀浆，每20 mg组织加入100~200 μL RIPA裂解液，冰上研磨棒研磨20 s，3次，涡旋匀浆30 s，冰上静置5 min，重复3次，4 ℃、14 000×g离心30 min，取上清，BCA蛋白浓度测定试剂盒测定总蛋白浓度。20~50 μg总蛋白上样量，以浓度为10%的凝胶电泳进行分离，湿法转膜。5%的脱脂奶粉封闭1 h后，与相应一抗4 ℃孵育过夜，0.1% PBS-T溶液洗涤，同属性二抗共孵育，增强型化学发光试剂进行显色，利用灰度分析软件定量分析。
2.5 qPCR检测β-catenin、Tcf7l2、Nppa和c-Myc mRNA表达取各组左心室组织50 mg，均匀粉碎后，按TRIzol提取程序说明书提取组织RNA; 在260 nm吸光值下定量RNA，按TaKaRa逆转录试剂盒操作说明，分两步在42 ℃ 2 min，37 ℃ 15 min，85 ℃ 5 s进行逆转录为cDNA。使用TaKaRa SYBR试剂盒在qPCR仪器上以95 ℃ 1 s、60 ℃ 20 s进行扩增，读取最后扩增数值。引物序列见Tab 1。
| Gene | Primer sequence | Product length/bp |
| Tcf7l2 | Forward 5′-GGGAAATCCACCTCCGCACT-3′ | |
| Reverse 5′-TCCTCCTGTCGTGATTGGGTACAC-3′ | 175 | |
| β-catenin | Forward 5′-TCAAGAGAGCAAGCTCATCATTCT-3′ | |
| Reverse 5′-CACCTTCAGCACTCTGCTTGTG-3′ | 115 | |
| Nppa | Forward 5′-ACCCTGGGCTTCTTCCTCGTCTT-3′ | |
| Reverse 5′-GCGGCCCCTGCTTCCTCA-3′ | 197 | |
| c-Myc | Forward 5′-TAACTCGAGGAGGAGCTGGA-3′ | |
| Reverse 5′-GCCAAGGTTGTGAGGTTAGG-3′ | 114 |
采用SPSS 16.0统计软件进行分析，多组间的比较采用单因素方差分析(one-way ANOVA)。
3 结果 3.1 心肌组织结构改变Fig 1的HE染色结果显示，CON组心肌细胞排列整齐，形态清晰；DM组心肌细胞排列紊乱，细胞结构模糊、表面积增大；与DM组相比，iCRT14组随药物剂量增加，细胞排列较整齐，形态逐渐均匀，逐渐趋向于正常细胞。
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| Fig 1 Morphological characteristics of diabetic cardiomyopathy by HE staining(×400) A:CON; B:DM; C:DM+iCRT14(2.5 mg·kg-1); D:DM+iCRT14(5 mg·kg-1) |
如Fig 2所示，正常组中β-catenin主要分布在心肌细胞连接的闰盘处，TCF7L2则散落分布在少数的心肌细胞核内。DM组中，β-catenin在闰盘和心肌细胞核内均见明显表达，且核内表达明显增多，提示DM时β-catenin入核增多；DM组心肌细胞核中TCF7L2表达明显增多，与β-catenin趋势一致。与DM组对比，给予iCRT14后，心肌细胞核内β-cate-nin表达减少，主要分布在闰盘和细胞质内，细胞核内TCF7L2表达也随之减少。提示1型DM时，TCF7L2和β-catenin在心肌细胞核内表达增多，给予iCRT14能明显抑制两者在细胞核内的表达和结合。
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| Fig 2 Expression and distribution of TCF7L2 and β-catenin in hearts by immunohistochemistry(×400) |
如Fig 3所示，与CON组对比，DM组活化β-catenin、总β-catenin、TCF7L2蛋白表达均明显增多；给予iCRT14能抑制β-catenin、TCF7L2蛋白的表达。该结果与免疫组化结果一致，提示1型DM心脏中β-catenin/TCF7L2信号通路活化，iCRT14能抑制β-catenin入核与TCF7L2结合，同时可抑制TCF7L2蛋白表达。
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| Fig 3 Expression of β-catenin and TCF7L2 in hearts by Western blot(x±s,n=5) ##P < 0.01 vs CON; **P<0.01 vs DM |
如Fig 4所示，与CON组相比，DM组Tcf7l2、c-Myc、Nppa mRNA表达上升，给予iCRT14后上述基因的mRNA水平下降，而β-catenin mRNA水平在DM组和iCRT14组有增加和减少的趋势，但差异无统计学意义。
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| Fig 4 β-catenin, Tcf7l2, c-Myc and Nppa mRNA expressions in myocardial tissue of mice(x±s,n=5) #P < 0.05, ##P < 0.01 vs CON; *P < 0.05, **P < 0.01 vs DM |
DCM主要表现为心室舒张和收缩功能降低、心肌肥厚、心肌间质纤维化等[9]。深入研究并阐明DCM的分子机制并找出早期的干预靶点，对建立更有效的糖尿病心血管并发症治疗方法具有十分重要的意义。
β-catenin作为经典Wnt通路的核心调控因子，在Wnt信号通路未被激活时，β-catenin在胞质内与腺瘤性结肠息肉病基因蛋白(adenomatous polyposis coli，APC)、轴蛋白(Axin)、糖原合酶激酶-3β(glycogen synthase kinase-3β，GSK-3β)、酪蛋白激酶1(casein kinase 1，CK1)等，形成“β-catenin降解复合物”，促进β-catenin进入蛋白酶体降解途径，使胞质内游离β-catenin维持在较低水平。Wnt通路激活后，促进β-catenin自降解复合物解离，减少蛋白酶体降解，使胞质内游离β-catenin稳定积累并进入细胞核内，由于β-catenin不含有DNA结合域，故当其进入细胞核后，需要与核内TCF7L2及其它TCF转录因子相互作用，形成转录激活复合物，激活下游靶基因转录。
研究表明，β-catenin在维持血浆葡萄糖的稳态中起着重要的作用。β-catenin转移至细胞核中，与LEF/TCF7L2结合形成异二聚体，激活胰高血糖素原基因等在内的大量基因发生转录，胰高血糖素原基因转录后，经不同的组织特异性加工，在胰岛α细胞表达产生胰高血糖素，使小肠L细胞表达产生胰高血糖素样肽-1(glucagon-like peptide 1, GLP-1)和胰高血糖素样肽-2(glucagon-like peptide 2，GLP-2)。其中，由小肠L细胞分泌的GLP-1不仅能刺激胰岛素合成与分泌，抑制胰高血糖素释放，增加外周胰岛素敏感性，还能通过抑制胃排空、增加机体饱胀感来降低血糖[10]。以往的研究显示，DM时高糖可通过激活β-catenin，加剧糖尿病视网膜病[11]。在肾脏中，高糖激活的β-catenin加速糖尿病肾病的病理生理进程[12]。国内也有研究发现，β-catenin的激活参与早期DM心肌损伤[13]。β-catenin/TCFL2信号通路在DCM中扮演何种角色，目前尚不清楚，亟待深入研究。因此，本课题通过建立1型DM小鼠模型，观察持续高血糖状态对心脏β-catenin/TCFL2信号通路的影响。结果发现，12周DM组心肌细胞排列紊乱，表面积增大，心肌肥大标志基因Nppa mRNA表达上调，呈现DCM的病理特征。免疫组化和Western blot结果显示，12周DM组心肌中β-catenin表达明显上调，且入核增多；TCF7L2蛋白表达也随之升高。随后，利用qPCR检测β-catenin/TCFL2通路的经典下游靶基因c-Myc表达。c-Myc是一种常见的原癌基因，主要通过参与细胞周期的调控，促进细胞增殖。已有研究显示，c-Myc过度表达能诱导心肌肥厚。课题组前期研究证实，c-Myc在心力衰竭的人类样本和转基因动物心脏中均表达增高，β-catenin/TCFL2信号通路通过上调c-Myc表达，参与心力衰竭的病程发展[14]。本研究qPCR结果显示，c-Myc mRNA表达在DM组的心脏中也明显增高。上述一系列结果提示，持续的高糖环境能激活心脏Wnt/β-catenin/TCFL2信号通路。
为进一步明确Wnt/β-catenin/TCFL2信号通路活化在DCM中的作用，我们选择新型β-catenin通路抑制剂iCRT14(Thiazolidinedione)处理DM组。iCRT14是最近报道的一种抑制β-catenin/TCF7L2结合的小分子化合物，能抑制β-catenin和TCF7L2的结合，同时还可干扰TCF家族与DNA的结合，抑制下游基因转录[15]。有体内外研究显示，iCRT14通过抑制Wnt/β-catenin信号转导，抑制乳腺癌和前列腺癌细胞增殖。本研究连续给予DM组腹腔注射iCRT14 8周，HE染色结果显示，iCRT14组心肌结构明显改善，细胞排列逐渐整齐，形态均匀，细胞核大小一致。免疫组化和Western blot结果显示，给予iCRT14后，β-catenin核内表达减少，TCF7L2表达降低。qPCR结果显示，c-Myc、Nppa mRNA表达均明显下降，接近CON组。该研究结果表明，iCRT14能阻断β-catenin/TCF7L2结合，抑制该信号通路的活性；同时提示，抑制Wnt/β-catenin/TCF7L2通路能明显改善DCM的病理表征。
综上所述，本课题研究发现，持续的血糖升高能激活心脏Wnt/β-catenin/TCF7L2信号通路，该通路的活化参与DCM的病理生理进程。在后续研究中我们将进一步在细胞水平，探索Wnt/β-catenin/TCF7L2信号通路在DM心肌重构中的具体作用和分子机制，为探索DCM治疗的新靶点提供实验依据。
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