2. 上海市第十人民医院中心实验室，上海 200072;
3. 上海市第十人民医院药学部，上海 200072;
4. 上海市第十人民医院崇明分院药剂科，上海 202157
2. Central Lab, Shanghai Tenth People′s Hospital, Shanghai 200072, China;
3. Dept of Pharmacy, Shanghai Tenth People′s Hospital, Shanghai 200072, China;
4. Dept of Pharmacy, Chongming Branch of Shanghai Tenth People′s Hospital, Shanghai 202157, China
胶质母细胞瘤(glioblastoma multiforme，GBM)是最具侵袭性的恶性原发性脑肿瘤，占原发性脑肿瘤的16%[1]。目前，GBM的标准治疗是手术配合放化疗，由于肿瘤所在位置及高侵袭性，手术难以完全切除[2]。替莫唑胺(temozolomide，TMZ)是GBM化疗的一线药物，主要通过使DNA甲基化而导致DNA错配修复系统失效，并最终导致肿瘤细胞死亡[3]。目前，GBM的治疗方法预后并不好，患者中位生存期只有15个月，仅有少部分存活达2.5年，5年生存率不到5%[1]。因此，GBM的治疗需要更加有效的方案。近来研究表明，胶质瘤细胞中多伴有磷脂酰肌醇-3-激酶(phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K)/Akt通路过度活化，该通路的激活促进了胶质瘤细胞的侵袭、转移及耐药的产生[4]。PI3K抑制剂BKM120可通过下调PI3K/Akt通路表达，恢复GBM细胞对TMZ的敏感性，增强其疗效[5]，提示该通路可作为GBM治疗的手段。
没药为橄榄科植物没药树的油胶树脂，没药甾酮(guggulsterone，GS)是没药中的主要活性成分，包含Z和E两种同分异构体[6]。目前研究表明，GS可通过抑制PI3K p85及Akt(Ser473)和(Thr308)位点磷酸化，抑制头颈癌细胞SCC4增殖，并诱导其凋亡[7]。但是GS对胶质瘤PI3K/Akt通路的调控作用，至今未有报道。我们前期研究发现，GS能增强化疗药物阿霉素对白血病细胞K562和乳腺癌细胞MCF-7的增殖抑制和凋亡诱导作用[8]。本文拟探讨Z-没药甾酮(Z-GS, 化学结构见Fig 1)能否通过下调PI3K/Akt通路，增强TMZ对人脑胶质瘤细胞的增殖抑制和凋亡诱导作用，为寻找新的GBM化疗方案提供理论依据。
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| Fig 1 Chemical structure of Z-guggulsterone |
Z-没药甾酮(Z-GS), 购自美国Sigma公司，溶于DMSO，配成母液16 003 μmol·L-1；TMZ购自美国Sigma公司，溶于DMSO，配成母液51 506 μmol·L-1；CCK-8，购自日本同仁化学研究所；Hoechst 33342染料，购自上海碧云天生物技术公司；凋亡试剂盒，购自美国Invitrogen公司；PI3K、p-PI3K、Akt、p-Akt(Ser473)、p-Akt(Thr308)、Bcl-2、Bax、β-actin抗体，购自美国Cell Signaling Technology公司。
1.2 仪器Synergy2多功能酶标仪(美国BioTek公司)；DMI 6000B倒置显微镜(德国Leica公司)；FACSCanto Ⅱ流式细胞仪(美国BD公司)；Odyssey双色红外激光成像系统(美国LI-COR公司)。
2 方法 2.1 细胞培养与药物处理人胶质瘤细胞U251，购自中国科学院上海细胞库。用含有10%胎牛血清、100 μmol·L-1青霉素和链霉素的DMEM培养液(美国Gibco公司)，在5% CO2、37 ℃条件下培养。当细胞长至培养皿底部80%时，用胰酶消化并接种至孔板中，待细胞长至孔板底部80%时，弃去旧培养液，分组加入含不同浓度药物的完全培养液。
2.2 CCK-8法检测细胞增殖取对数生长期细胞接种于96孔板中，每孔细胞量为1×104，每孔液体量为100 μL。Z-GS和TMZ单药处理的药物浓度梯度均为1、3、10、30、100、200、400 μmol·L-1；Z-GS与TMZ联合使用中，TMZ(1、3、10、30、100、200、400 μmol·L-1)分别与30 μmol·L-1 Z-GS联合使用，每个浓度3个复孔。细胞经药物处理12、24、48 h后，加入10% CCK-8试剂，于培养箱中反应2 h，用酶标仪测450 nm处OD值。每组实验重复4次。使用公式：存活率/%=OD实验组平均值/OD对照组平均值×100%，计算细胞存活率。
2.3 合用指数(combination index, CI)计算使用Excel 2016软件，得到GS和TMZ单药的拟合量效曲线及函数方程。使用公式CI=DA, x/DB, x+ICx, A/ICx, B计算CI，其中DA, x和DB, x为两药联用达到x效应时两药的浓度，ICx, A和ICx, B为两药单独使用时达到x效应所需的浓度。CI < 1表示两药协同，CI=1表示两药相加，CI> 1表示两药拮抗[9]。
2.4 Hoechst 33342染色取对数生长期细胞接种于6孔板中，每孔细胞量为3×105，每孔液体量为2 mL。用Z-GS(30 μmol·L-1)和TMZ(400 μmol·L-1)单药及两药联合处理细胞24 h。弃培养液，每孔加Hoechst 33342试剂1 mL，置于培养箱中30 min，弃染料，PBS洗3遍，使用倒置荧光相差显微图像系统观察并采集图像。
2.5 流式细胞术检测细胞凋亡取对数生长期细胞接种于6孔板中，每孔细胞量为3×105，每孔液体量为2 mL。用Z-GS(30 μmol·L-1)和TMZ(400 μmol·L-1)单药及两药联合处理细胞。药物处理细胞24 h后分别收集细胞和上清液，PBS洗2次，胰酶消化，与之前收集的上清液混合，细胞悬液1 000 r·min-1离心5 min，弃上清，PBS重悬，1 000 r·min-1离心5 min，弃上清，加入1×binding buffer 50 μL重悬，再加入Annexin V-FITC 5 μL，避光反应15 min，加入PI 5 μL，5 min后加入1×binding buffer 300 μL混匀，使用流式细胞仪检测，使用FACSDIVA软件分析。实验重复3次。
2.6 Western blot检测蛋白表达取对数生长期细胞接种于6孔板中，每孔细胞量为3×105，每孔液体量为3 mL。用Z-GS单药(30 μmol·L-1)、TMZ单药(400 μmol·L-1)及两药联合处理细胞，24 h后提取蛋白。BCA法测定样品蛋白浓度，上样量为50 μg。样品经SDS-PAGE电泳分离，之后转移至NC膜上，用5% BSA室温下在摇床上封闭1 h，用封闭液稀释抗体(β-actin抗体按1 :5 000稀释，其余一抗按1 :1 000稀释)，一抗4 ℃过夜孵育，之后用PBST洗膜3次，每次10 min，二抗室温下避光孵育1 h，PBST洗膜3次，每次10 min，用Odyssey红外激光成像系统采集图片，用Odyssey软件分析图像。实验重复3次。
2.7 统计学分析使用SPSS 17.0软件进行数据分析。组间均数比较采用两独立样本t检验。
3 结果 3.1 Z-GS、TMZ及两药联合对U251细胞增殖的影响Fig 2、3结果显示，Z-GS和TMZ对U251细胞的增殖抑制作用呈时间及浓度依赖性。与TMZ单药组相比，GS联合TMZ能明显增强对U251细胞的增殖抑制作用。
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| Fig 2 Effects of Z-guggulsterone on proliferation in U251 cells(x±s,n=4) U251 cells were treated with Z-guggulsterone(1~400 μmol·L-1) for 12 h, 24 h or 48 h as determined by CCK-8.*P<0.05, **P<0.01 vs control. |
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| Fig 3 Effects of temozolomide or temozolomide combined with Z-guggulsterone on proliferation of U251 cells(x±s,n=4) U251 cells were treated with temozolomide(1~400 μmol·L-1) alone or in combination with Z-guggulsterone(30 μmol·L-1) for 12 h(A), 24 h(B) or 48 h(C) as determined by CCK-8.*P<0.05, **P<0.01 vs control; #P<0.05, ##P<0.01 vs TMZ alone at the same concentration. |
Fig 4结果显示，与对照组相比，Z-GS单独给药组细胞凋亡率为(5.3±1.0)%，TMZ单独给药组细胞凋亡率为(12.7±1.7)%；与TMZ单独给药组相比，联合给药能明显增强对U251细胞凋亡诱导作用，凋亡率上调至(29.5±4.3)%(P<0.01)。
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| Fig 4 Z-Guggulsterone increased temozolomide-induced apoptosis in U251 cells(x±s,n=4) U251 cells were treated with Z-guggulsterone(30 μmol·L-1) and temozolomide(400 μmol·L-1) alone or in combination for 24 h. A:Nuclear morphology of U251 cells stained with Hoechst 33342; B: Flow cytometric analyses of Annexin V-FITC/PI double staining; C: Apoptosis rate from flow cytometer analysis.**P<0.01 vs control; ##P<0.01 vs TMZ. |
Fig 5结果显示，与对照组相比，Z-GS单独给药组明显下调了PI3K、p-PI3K p110、Akt和p-Akt(Thr308)表达，TMZ单独给药组明显下调了PI3K、p-PI3K p110、p-PI3K p85和p-Akt(Ser473)表达；与TMZ单独给药组相比，联合给药明显下调了PI3K、p-PI3K p110和p-Akt(Ser473)表达。
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| Fig 5 Effects of Z-GS and TMZ on expression of PI3K, p-PI3K p110, p-PI3K p85(A) and Akt, p-Akt(Ser473), p-Akt(Thr308)(B) in U251 cells(x±s,n=3) U251 cells were treated with Z-GS(30 μmol·L-1) and TMZ(400 μmol·L-1) alone or in combination for 24 h.*P<0.05, **P<0.01 vs control, #P<0.05, ##P<0.01 vs TMZ. |
Fig 6结果显示，与对照组相比，两药单独给药对Bcl-2和Bax表达影响均无统计学差异(P>0.05)；与TMZ单独给药组相比，联合用药明显下调了Bcl-2表达(P<0.01)。
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| Fig 6 Effects of Z-GS and TMZ on expressions of Bcl-2 and Bax in U251 cells(x±s,n=3) U251 cells were treated with Z-GS(30 μmol·L-1) and TMZ(400 μmol·L-1) alone or in combination for 24 h.**P<0.01 vs control, ##P<0.01 vs TMZ. |
本实验结果显示，与TMZ单独给药相比，Z-GS能增强TMZ对U251细胞的增殖抑制和凋亡诱导作用。进一步研究显示，与TMZ单独给药相比，GS能明显下调PI3K、p-PI3K p110、p-Akt(Ser473)和Bcl-2的表达。研究结果表明，没药甾酮可通过下调PI3K/Akt通路，增强替莫唑胺对人脑胶质瘤细胞U251的增殖抑制作用。
PI3K由催化亚基p110和调节亚基p85组成，p85与效应物结合后释放出p110，p110将磷脂酰肌醇二磷酸(phosphatidy-linositol-3, 4-bisphosphate，PIP2)磷酸化为磷脂酰肌醇三磷酸(phosphatidy-linositol-3, 4, 5-bisphosphate，PIP3)，PIP3招募Akt，并使其Thr308和Ser473位点磷酸化[10]。其中，Thr308残基位于Akt的核心，其磷酸化为Akt活化所必需，Ser473残基的磷酸化能稳定Thr308磷酸化和Akt活化状态，使Akt活性最大化[11]。Akt可以激活下游的目的蛋白，如核转录因子κB(nuclear factor-kappa B，NF-κB)、mTOR等，从而促进细胞增殖[12]。Chen等[13]研究发现，PI3K抑制剂LY294002能抑制脑胶质瘤U87细胞中PI3K和p-Akt水平，与TMZ联用，增强其对U87细胞的增殖抑制作用。Mao等[5]研究发现，PI3K抑制剂BKM120也能通过下调PI3K、p-Akt，恢复胶质瘤细胞C6对TMZ的敏感性。还有研究表明，通过抑制Akt下游的NF-κB，也可促进胶质瘤细胞凋亡[14]。本研究发现，Z-GS通过下调PI3K、p-PI3K p110和p-Akt(Ser473)表达，增强TMZ对U251细胞的增殖抑制和凋亡诱导作用。
磷酸化的Akt可通过磷酸化BAD，释放出Bcl-2，抑制细胞凋亡[15]。Chen等[13]研究发现，与单独使用TMZ相比，PI3K抑制剂LY294002联合TMZ可明显下调脑胶质瘤U87细胞中Bcl-2的表达，同时上调Bax表达。Mao等[5]研究发现，与单独使用TMZ相比，PI3K抑制剂BKM120联合TMZ可明显上调脑胶质瘤C6细胞中Bax表达。本研究发现，与单独使用TMZ相比，Z-GS联合TMZ可明显下调脑胶质瘤U251细胞中Bcl-2的表达。
TMZ作为GBM的一线化疗药物，其单独使用的疗效并不令人满意，本实验结果表明，Z-GS有望改善TMZ的疗效，具有与TMZ联合用于GBM治疗的应用前景。但Z-GS对胶质瘤PI3K/Akt通路影响及联合作用机制，仍需要进一步的研究，今后还将开展体内实验，为Z-GS用于GBM治疗提供依据。
( 致谢: 本实验在上海市第十人民医院中心实验室完成，感谢各位老师的帮助。)
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