胰岛素抵抗(insulin resistance,IR)是2型糖尿病(type 2 diabetes mellitus,T2DM)的生理病理基础,主要表现为胰岛素敏感性降低,不能促进外周靶组织(肝脏、脂肪组织、骨骼肌)的葡萄糖摄取和利用[1]。IR被认为是引发T2DM的始动因素[2],改善IR对T2DM的治疗及防治并发症具有重要意义。
T2DM属于中医学“消渴”范畴,病机特点为阴虚为本、燥热为标。知母-黄柏药对(Zhimu-Huangbai herb pair,ZB)出自《兰室秘藏》,又名疗本滋肾丸,二者相须为用,主治阴虚燥热、骨蒸盗汗,是典型的治疗消渴的药对[3]。现代药理研究表明,知母-黄柏药对中的芒果苷、知母皂苷、小檗碱等有效成分对IR均具有改善作用[4-6],而其作为治疗消渴的典型药对,对IR的影响目前尚不清楚。因此,本研究建立T2DM大鼠模型及HepG2细胞IR模型,从糖脂代谢方面探讨药对知母-黄柏对IR的药效作用。
1 材料 1.1 药物与试剂链脲佐菌素(streptozotocin,STZ),纯度>98%,Sigma公司,批号: 111607-200301,用前用柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液溶解;无脂肪酸牛血清白蛋白(bovine serum albumin,BSA),购于北京索莱宝公司;棕榈酸钠、油酸钠,均购自Sigma公司,加超纯水于75 ℃水浴溶解完全后,与无脂肪酸BSA溶液混匀并过滤除菌,用前采用培养液稀释成含3% BSA、1 mmol·L-1棕榈酸(palmitic acid,PA)和2 mmol·L-1油酸(oleic acid,OA)的高脂添加剂;DMEM高糖培养基、南美胎牛血清、青霉素-链霉素溶液,均购自美国Gibco公司;胰岛素ELISA试剂盒,购于上海酶联生物科技有限公司;葡萄糖氧化酶法检测试剂盒,购自南京建成;甘油三脂(triglyceride,TG)检测试剂盒,购自北京普利莱;盐酸二甲双胍,购自中美上海施贵宝制药有限公司。
黄柏(批号: 141112771,产地四川)、知母(批号: 140806121,产地河北)饮片,均购自广东康美药业股份有限公司,用前粉碎至适当细度并过筛,知母黄柏按1:1比例充分混合(低剂量组20 g:20 g,高剂量组60 g:60 g),之后置于圆底烧瓶,加纯水至250 mL,浸泡0.5 h后,回流装置煎煮1 h,过滤,加入纯水250 mL继续煎煮1 h,过滤,合并滤液,浓缩并定容至200 mL,于4 ℃冰箱保存,用于动物灌胃给药。以上浓缩液取部分,置于-80 ℃冰箱预冻后,放入已事先降至预定温度的冷冻干燥机中,干燥24 h,得到知母-黄柏药对冻干粉,4 ℃冰箱保存,用于细胞给药,用前采用培养液溶解并滤菌。
1.2 实验动物与细胞SPF级♂SD大鼠,体质量(180±10)g,由广东省医学实验动物中心提供,合格证号:(粤)44007200026586。动物饲养于广东省中医院实验动物中心,饲养温度(20±2.0)℃,相对湿度40%~60%, 照明昼夜明暗交替周期为12 h,所有大鼠自由摄食、饮水。高脂高糖饲料:蔗糖20%、猪油10%、胆固醇1.2%、胆酸钠0.2%、酪蛋白10%、磷酸氢钙0.6%、石粉0.4%、预混料0.4%、基础饲料57.2%,由广东省实验动物中心提供。HepG2细胞株,来源于中国科学院上海生命科学研究院细胞资源中心。
1.3 仪器AB135-S电子天平(Mettler Toledo公司);Orion Star A211台式pH测量仪(美国赛默飞世尔科技公司);Synergy H1型多功能酶标仪(美国佰腾仪器有限公司);LDZ5-2台式离心机(北京医用离心机厂)。
2 方法 2.1 动物模型的建立SD大鼠30只,适应性喂养3 d。随机抽取6只大鼠作为正常组(Control),普通饲料喂养,其余24只大鼠采用高脂高糖饲料喂养。4周后,正常组大鼠按照10 mL·kg-1注射柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液,其余24只大鼠按照35 mg·kg-1剂量腹腔注射STZ。造模前禁食不禁水12 h,注射STZ后d 7检测空腹血糖(fasting blood glucose, FBG), FBG>16.7 mmol·L-1为造模成功的标准。
2.2 动物模型的分组及给药24只大鼠造模成功后,随机分为模型组(Model)、二甲双胍组(Metformin)、知柏高剂量(ZB 4.5 g·kg-1)和低剂量(ZB 1.5 g·kg-1)组,每组6只。二甲双胍组按0.25 g·kg-1灌胃给予盐酸二甲双胍混悬液,知柏高、低剂量组分别按照生药4.5、1.5 g·kg-1灌胃给予知母-黄柏水煎液;模型组与正常组按照10 mL·kg-1灌胃生理盐水。各组大鼠每天灌胃1次,连续给药4周。
2.3 各组动物体质量、FBG、胰岛素、TG的检测测定各组大鼠造模前(STZ注射前)与给药前(STZ注射d 7)的空腹体质量与空腹血糖。给药4周后,各组大鼠禁食不禁水12 h,再测1次空腹体质量,乙醚麻醉后眼眶采血0.5 mL,3 000 r·min-1离心10 min,取血浆备用,用于检测FBG、血清胰岛素(fasting insulin,FINS)水平及TG含量。FBG及FINS分别采用葡萄糖测定试剂盒和胰岛素ELISA试剂盒测定。葡萄糖试剂盒为氧化酶法,胰岛素试剂盒为双抗夹心法,并按以下公式计算胰岛素敏感指数(insulin sensitivity index,ISI)和胰岛素抵抗指数(homeostasis model assessment-insulin resistance index,Homa-IR):ISI=ln[1/(FBG×FINS)],Homa-IR=FBG×FINS/22.5。TG由广东省实验动物检测所采用日立7020全自动生化分析仪检测。
2.4 HepG2细胞IR模型的建立、分组及给药HepG2细胞株用含10% FBS、1%青/链霉素的高糖DMEM,于37 ℃、5% CO2的培养箱中培养,取对数生长期的HepG2细胞,以6 000个细胞每孔接种至96孔板,每孔200 μL,分为正常组(Control)、模型组(Model)、二甲双胍组(Metformin,5 mmol·L-1)、知柏高、中、低剂量组(ZB生药384、192、96 mg·L-1),每组设3个复孔。待细胞长至80%左右,正常组加入含3% BSA的培养液,其他各组加入含3% BSA、1 mmol·L-1 PA和2 mmol·L-1 OA的培养液分别诱导24 h,构建IR模型,成功制备IR模型后给药24 h。
2.5 HepG2细胞葡萄糖消耗量测定将HepG2细胞株接种至96孔培养板培养,培养方式及实验分组同“2.4”,并设置空白对照孔。给药24 h后,取上清,用葡萄糖氧化酶法检测各实验组培养液中的葡萄糖含量,计算葡萄糖消耗量:葡萄糖消耗量=空白孔葡萄糖含量-测定孔葡萄糖含量。考虑细胞增殖可能对葡萄糖消耗造成影响,各孔取上清后,再利用MTT法测定孔底细胞活力,用于校正葡萄糖消耗量(葡萄糖消耗量/细胞活力)。
2.6 HepG2细胞内TG含量测定将HepG2细胞以每孔1.2×105个接种至6孔培养板培养,培养方式及实验分组同“2.4”。给药24 h后,弃各孔培养液,加细胞裂解液萃取细胞内的TG,收集的细胞裂解液70 ℃加热10 min后,2 000 r·min-1离心5 min,取上清,利用TG检测试剂盒测定TG含量,并用BCA试剂盒测定其蛋白浓度,用于校正TG含量。
2.7 统计学分析应用SPSS 19.0软件进行统计学分析,计量资料用x±s表示,组间比较用独立样本t检验,多组间比较用ANOVA方差分析。
3 结果 3.1 知母-黄柏对糖尿病大鼠体质量的影响STZ注射前各组大鼠体质量无明显差异,注射7 d后,模型组、二甲双胍组、知柏高、低剂量组体质量均明显低于正常组(P<0.05),大鼠出现多饮多食多尿消瘦,即“三多一少”症状,符合糖尿病的临床特征。给药4周后,正常组大鼠体质量持续增长,其他各组体质量持续减轻,且明显低于正常组(P<0.01),模型组与各给药组之间无明显差异(Tab 1)。
Group | Before STZ | After STZ 7 d | After 4-week treatment |
Control | 431±13 | 450±15 | 518±24 |
Model | 437±27 | 387±30* | 343±45** |
Metformin | 434±14 | 392±25* | 358±28** |
ZB 4.5 g·kg-1 | 449±31 | 392±27* | 332±28** |
ZB 1.5 g·kg-1 | 426±23 | 398±22* | 361±31** |
*P<0.05, **P<0.01 vs control |
STZ注射前,各组大鼠FBG值均差异无显著性。STZ注射d 7,模型组、二甲双胍组、知柏高、低剂量组FBG明显高于正常组(P<0.01),4组之间FBG差异无显著性。给药4周后,与模型组相比,二甲双胍组、知柏高、低剂量组FBG均明显降低(P<0.05),各给药组之间无明显差异(Tab 2)。
Group | Before STZ | After STZ 7 d | After 4-week treatment |
Control | 5.64±0.71 | 5.09±0.70 | 3.13±0.50 |
Model | 5.62±1.81 | 19.73±1.31** | 27.04±2.24** |
Metformin | 5.60±0.40 | 20.42±1.99** | 21.61±2.44#** |
ZB 4.5 g·kg-1 | 6.37±0.69 | 21.04±1.13** | 22.82±1.72#** |
ZB 1.5 g·kg-1 | 5.38±0.78 | 20.58±1.27** | 22.94±2.28#** |
**P<0.01 vs control; #P<0.05 vs model |
给药前各组大鼠FINS含量差异均无显著性。给药4周后,与正常组相比,模型组FINS升高,ISI明显下降(P<0.01),Homa-IR明显上升(P<0.01),表明糖尿病模型大鼠体内胰岛素敏感性降低,胰岛素抵抗指数升高,出现明显的胰岛素抵抗特征。与模型组相比,二甲双胍组、知柏高、低剂量组ISI明显升高(P<0.05),Homa-IR明显降低(P<0.01);知柏高、低剂量组亦能明显降低FINS含量(P<0.05),二甲双胍组FINS含量亦有下降,但无统计学差异(Tab 3)。
Group | After STZ 7 d(FINS) | After 4-week treatment | ||
FINS | ISI | Homa-IR | ||
Control | 23.72±7.64 | 55.41±5.73 | -5.14±0.25 | 7.77±1.86 |
Model | 30.02±3.40 | 62.76±4.90 | -7.43±0.01** | 75.11±0.67** |
Metformin | 33.54±8.60 | 44.30±12.26 | -6.78±0.29# | 40.14±11.12## |
ZB 4.5 g·kg-1 | 30.23±3.50 | 47.72±8.48# | -6.89±0.32# | 45.15±12.68## |
ZB 1.5 g·kg-1 | 30.38±6.99 | 42.94±10.10# | -6.87±0.26# | 43.91±11.53## |
**P<0.01 vs control; #P<0.05,##P<0.01 vs model |
STZ注射d 7,模型组、二甲双胍组、知柏高、低剂量组TG含量明显高于正常组(P<0.05),4组之间TG含量差异无显著性。给药4周后,模型组TG含量持续升高,明显高于正常组(P<0.01);与模型组相比,各给药组TG含量明显降低(P < 0.05),各给药组之间无明显差异(Tab 4)。
Group | After STZ 7 d | After 4-week treatment |
Control | 1.05±0.38 | 0.58±0.17 |
Model | 2.57±0.23* | 4.58±1.15** |
Metformin | 2.02±0.52* | 2.23±0.14# |
ZB 4.5 g·kg-1 | 2.61±0.89* | 1.88±0.50# |
ZB 1.5 g·kg-1 | 2.28±0.59* | 1.93±0.69# |
*P<0.05, **P<0.01 vs control; #P<0.05 vs model |
与正常组相比,模型组糖耗量明显下降(P<0.01);给予二甲双胍或知柏高、中、低剂量后,细胞葡萄糖消耗量明显升高(P<0.05),各给药组与模型组之间细胞活性差异无显著性(Tab 5)。
Group | Glucose consumption /mmol·L-1 | Cell viability/% |
Control | 2.75±0.03 | 100.0±0.0 |
Model | 2.01±0.02** | 98.3±4.6 |
Metformin | 4.13±0.47## | 95.3±2.5 |
ZB 384 mg·L-1 | 3.69±0.41# | 96.3±5.3 |
ZB 192 mg·L-1 | 4.17±0.86# | 96.3±4.2 |
ZB 96 mg·L-1 | 3.98±0.83# | 100.4±3.3 |
**P<0.01 vs control; ##P<0.01, #P<0.05 vs model |
HepG2胰岛素抵抗细胞的TG含量与正常组相比明显升高(P<0.01);二甲双胍、知柏高、中剂量组TG含量相比模型组明显下降(P<0.05),知柏低剂量组亦有下降,但差异无统计学意义(Fig 1)。
4 讨论T2DM是威胁人类健康的重要代谢性疾病,其患病率呈逐渐增长的趋势,而IR作为T2DM的重要特征,存在于整个疾病的发生发展过程,是研究T2DM发病机制的首选对象[7]。张蕾等[8]研究表明,高脂高糖饮食可以引起肝细胞内TG过度堆积为主要病理特征的脂肪肝IR大鼠模型。本实验利用STZ联合高脂高糖饲料喂养的方法建立糖尿病大鼠模型,结果显示,模型组大鼠出现多饮、多食、多尿、体质量减轻的临床“三多一少”症状,并且出现高血脂、高血糖、高Homa-IR及低ISI的生化指标特征,符合T2DM基本特征IR的临床特点,提示造模成功。
肝脏是调节机体能量平衡,尤其是糖、脂代谢的主要器官,因此,肝脏的IR在机体IR中占有重要地位。HepG2细胞源于人的肝胚胎瘤细胞株,在高水平的胰岛素条件下,其表面胰岛素受体的数目下降程度与胰岛素水平及刺激持续的时间呈正相关[9],因此HepG2细胞是体外研究IR发病机制和降糖药物作用机制的理想细胞模型。高浓度游离脂肪酸可以导致肝脏脂肪沉积,促使糖脂代谢异常, 从而引发IR[10]。本实验采用含1 mmol·L-1棕榈酸和2 mmol·L-1油酸的培养液,体外培养诱导HepG2细胞24 h,建立肝脏IR细胞模型。结果表明,细胞的葡萄糖消耗能力下降,胞内TG含量升高,符合肝脏细胞IR的代谢特征,表明模型建立成功。
本实验结果显示,药对知母-黄柏对糖尿病大鼠及HepG2胰岛素抵抗细胞均有明显的降糖、降脂作用,有效改善糖脂代谢紊乱症状。动物实验中,相比给药前、给药4周后模型组的FBG及TG含量持续升高,而各给药组FBG及TG含量无明显改变, 说明药对知母-黄柏对糖尿病大鼠FBG及TG含量的进一步升高有抑制作用,且作用强度与二甲双胍相近。另外,二甲双胍及知柏低剂量对糖尿病大鼠体质量的降低有一定的缓和作用,而知柏高剂量组大鼠体质量相对模型组有所降低,可能是因为知母和黄柏均为寒凉药物,长期高剂量给药导致大鼠脾虚,从而体质量减轻的症状并无明显改善。细胞实验研究表明,知柏高、中剂量均能明显增加HepG2胰岛素抵抗细胞的葡萄糖消耗量,并同时降低TG含量,且中剂量作用强度稍强于二甲双胍。另外,各给药组细胞活力与模型组细胞活性基本一致,表明知母-黄柏的降糖作用不依赖于细胞的增殖。
二甲双胍作为T2DM的首选药物,其降糖机制主要是通过抑制肝脏糖异生,增加周围组织对胰岛素的敏感性,从而使血糖水平降低[11]。本文研究表明,药对知母-黄柏高、低剂量均能明显降低糖尿病大鼠胰岛素抵抗指数及血浆胰岛素水平,提升胰岛素敏感指数,对IR具有一定的改善作用,且效果与二甲双胍相当。此结果提示,降低胰岛素抵抗指数,提升胰岛素敏感性是药对知母-黄柏改善IR糖脂代谢紊乱的作用机制之一。
本文从动物及细胞水平证实了药对知母-黄柏对IR具有明显的改善作用,表明其作用是通过降低胰岛素水平,提升胰岛素敏感性,促进糖脂代谢来实现的,为临床指导用药提供了重要依据。
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