组织缺氧、缺血、再灌注、氧化应激、高渗应激等刺激因素，诱发心肌细胞凋亡[1]。阿霉素(doxorubicin，DOX)临床使用时经常诱发患者心脏毒性，主要通过引起终期分化心肌细胞和心脏祖细胞凋亡，进而导致心肌组织或固有的再生能力缺失[2-4]。DOX也影响心肌细胞与肝细胞生长因子、胰岛素样生长因子等的反应[5]。心肌肽(cardiomyopeptide，Car)是从乳猪心脏中提取的多肽类活性物质，可直接作用于心肌细胞，预防和保护心脏缺血/再灌注等多种因素下心肌损伤的修复[6]，临床试验也表明，其具有良好的心肌保护作用[7]。2005年，心肌肽被国家食品药品监督管理局批准为一类化学药，用于心脏外科手术围术期心肌保护的辅助药物。本实验采用DOX损伤H9c2心肌细胞，研究心肌肽的保护作用及对胰岛素样生长因子1受体(insulin-like growth factor 1 receptor，IGF-1R)、胰岛素样生长因子结合蛋白3(insulin-like growth factor binding protein 3，IGFBP-3)等蛋白表达的影响，揭示其可能的作用机制。
1 材料 1.1 细胞系大鼠心肌细胞株H9c2细胞，购自中国科学院上海生命科学研究院生物化学与细胞生物学研究所。
1.2 药物与试剂心肌肽(大连珍奥药业有限公司，批号：20170401、20170302、20170103)；盐酸阿霉素(美国MCE公司)；胰蛋白酶、增强化学发光液(北京全式金生物技术有限公司)；MTT、二甲基亚砜(dimethyl sulfoxide，DMSO)(美国Solarbio公司)；DMEM高糖培养基、胎牛血清(fetal bovine serum，FBS)(美国Gibco公司)；BCA蛋白浓度测定试剂盒、IP细胞裂解液、苯甲基磺酰氟(phenylmethanesulfonyl fluoride，PMSF)(碧云天生物技术研究所)；兔源一抗Bax、Bcl-2、caspase-3、IGF-1R、IGFBP-3、β-actin(美国Proteintech公司)；兔源二抗(武汉三鹰生物技术有限公司)。
1.3 仪器H-1650离心机(长沙湘仪离心机仪器有限公司)；超纯水装置(美国Cascada)；CF16RX高速冷冻离心机、U-3010紫外可见分光光度计(日本HITACHI)；酶标仪(美国Thermo)；DYCZ-40D转印电泳仪(北京市六一仪器厂)；JM-250型电泳仪(大连竞迈生物科技有限公司)；UVP凝胶成像系统(美国BioSpectrum)；TE2000-U显微镜(日本Nikon)；CCL-170B-8型CO2培养箱(新加坡ESCO)。
2 方法 2.1 细胞培养H9c2细胞培养于含10% FBS的DMEM高糖培养基中，37 ℃、5% CO2、饱和湿度条件下培养，待细胞密度达到80%~90%时，用0.25%胰蛋白酶消化传代，取对数生长期细胞进行实验。
2.2 MTT法测定心肌细胞存活率取对数生长期细胞，0.25%胰蛋白酶消化后，以1×108·L-1细胞浓度接种于96孔板内，每孔100 μL，孵育24 h后分组，各组均设6个复孔。实验组加入心肌肽使浓度分别为0、10、20、40 mg·L-1，预处理6、8、12 h后，与模型组同时加入DOX(终浓度为1 μmol·L-1)，继续培养24 h后，每孔加入5 g·L-1 MTT溶液10 μL，4 h后吸除培养基，加入DMSO 150 μL，摇床上低速振摇10 min，使结晶充分溶解后，在570 nm处测定吸光度，计算细胞存活率。同时考察40 mg·L-1心肌肽预处理8 h，对DOX半抑制浓度(IC50)的影响。按照以下公式计算细胞存活率：细胞存活率=实验组吸光度值/正常对照组吸光度值×100%。
2.3 Western blot测定蛋白表达以1×108·L-1浓度将细胞接种到6孔板中，24 h后，加入心肌肽(0、10、20、40 mg·L-1)预处理8 h，再分别加入DOX(终浓度为1 μmol·L-1)，24 h后吸除细胞培养基，用冷PBS洗涤2次，吸除残留液体；胰酶消化，将收集到的细胞置1.5 mL离心管内，PBS洗涤2次，每孔加入IP裂解液100 μL，充分吹打，置于4 ℃下裂解15 min后，10 000 r·min-1离心10 min，取上清液，蛋白含量测定后，用质量分数为7.5%和12.5%的SDS-PAGE分离。湿转膜法转到PVDF膜上，封闭3 h，TBS-T洗涤3次，每次10 min。加入一抗，4 ℃冰箱孵育过夜后，TBS-T洗涤3次，每次10 min。加入相应的二抗孵育3 h，TBS-T洗涤3次，每次10 min，用ECL Western blot检测系统对蛋白条带进行分析，检测蛋白表达情况。
2.4 统计学分析实验数据以x±s表示，采用GraphPad Prism 7软件进行统计学分析，各组间比较采用单因素方差分析，各组间两两比较采用配对t检验。
3 结果 3.1 心肌肽对H9c2心肌细胞存活率的影响如Fig 1所示，与DOX组相比，心肌肽10 mg·L-1预处理12 h，细胞存活率提高(10.1±3.8)%；心肌肽浓度为20 mg·L-1时，细胞存活率提高(13.9±3.7)%(8 h)和(25.5±3.3)%(12 h)；心肌肽浓度为40 mg·L-1时，细胞存活率提高(12.6±2.4)%(6 h)、(25.6±2.0)%(8 h)和(34.3±6.0)%(12 h)，均可明显提高细胞存活率(P < 0.05)。结果表明，心肌肽可以保护受损的心肌细胞，对细胞保护作用呈时间和剂量依赖性。
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| Fig 1 Effect of cardiomyopeptide on DOX-induced apoptosis in H9c2 cardiac cells(x±s, n=6) *P < 0.05 vs DOX group |
如Fig 2所示，心肌肽40 mg·L-1预处理8 h，可使DOX的IC50值由(1.2±0.4)μmol·L-1右移至(2.3±0.2)μmol·L-1(P＜0.01)。提示心肌肽预处理可减轻DOX的细胞毒性，并促进细胞增殖。
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| Fig 2 Effect of cardiomyopeptide on dose-dependent DOX-induced H9c2 cytotoxicity(x±s, n=6) |
如Fig 3结果显示，与对照组相比，DOX组Bax和caspase-3蛋白表达量增加(P < 0.01)。心肌肽(20、40 mg·L-1)预处理H9c2细胞8 h，随着药物浓度的增加，Bax和caspase-3蛋白表达量降低，Bcl-2蛋白表达量增加(P < 0.01)。表明心肌肽通过增加Bcl-2表达，抑制caspase-3活性发挥抗凋亡活性。
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| Fig 3 Effect of cardiomyopeptide on the expression of Bcl-2, Bax and caspase-3 under doxorubicin treatment in H9c2 cells(x±s, n=3) **P < 0.01 vs control group; ##P < 0.01 vs DOX group |
如Fig 4所示，与对照组相比，DOX组IGFBP-3蛋白表达量增加，而IGF-1R蛋白表达量减少(P < 0.05)。心肌肽40 mg·L-1预处理8 h，可明显增加IGF-1R表达(P < 0.05)，而经心肌肽(20、40 mg·L-1)预处理8 h的H9c2细胞，IGFBP-3蛋白表达减少(P < 0.05)，且呈剂量依赖性。表明心肌肽保护DOX引起的心肌细胞损伤作用可能与调节IGF-1系统有关。
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| Fig 4 Effect of cardiomyopeptide on the expression of IGF-1R and IGFBP-3 caused by doxorubicin in H9c2 cells(x±s, n=3) #P < 0.05 vs control group; *P < 0.05 vs DOX group |
细胞凋亡通常是由于线粒体渗透性改变，导致细胞色素C释放，caspase-3被激活引起。大量结果表明，Bcl-2和Bax在凋亡通路中有重要作用[8]，Bcl-2可与Bax形成异源二聚体，阻止Bax向线粒体移位，减少线粒体通透性，抑制Bax的促凋亡作用[9]。Bcl-2作为抗凋亡因子，其同源二聚体可以维持线粒体的稳态，而且Bax同源二聚体可以直接激活caspase-3。Bcl-2和Bax基因在凋亡过程中是功能对立的重要调控基因，caspase-3是凋亡过程中重要的执行蛋白酶，Bcl-2、Bax通过调控caspase-3活性而发挥抗凋亡作用[10]。IGF-1具有多重细胞生物学作用，包括促细胞生长、分化及抗凋亡作用，是心肌细胞重要的生长、生存因子，能调节人或实验动物的心脏功能，如改善DOX引起的心肌病变和在心肌缺血、心衰实验模型中减少心肌细胞死亡。
IGF-1减少0.5 μmol·L-1 DOX引起的细胞凋亡[11]，但对1 μmol·L-1 DOX无效[12]。在无血清培养基或DOX诱导的H9c2细胞凋亡实验中，IGF-1抗凋亡作用与Bax表达、caspase-3活性和DNA裂解有关，IGF-1通过减少Bax表达和抑制caspase-3活性，提高细胞存活率[13]。IGF-1缺氧引起的新生心肌细胞抗凋亡因子Bcl-2蛋白表达水平增加[14]。DOX通过影响IGF-1系统，使H9c2细胞的IGF-1R蛋白表达下调、IGFBP-3上调，IGFBP-3也通过IGF-1非依赖机制引起细胞凋亡[13]。N-乙酰半胱氨酸、右丙亚胺和卡维地洛等抗氧化剂预处理后，也通过调节IGF-1系统，发挥抗凋亡作用[15]。
本实验结果表明，心肌肽40 mg·L-1预处理8 h，可明显对抗1 μmol·L-1 DOX引起的细胞凋亡，使细胞存活率提高(25.6±2.0)%。Western blot结果显示，与正常组相比，DOX组的促凋亡蛋白Bax表达量明显增加，而抑制凋亡蛋白Bcl-2的表达量减少；心肌肽组可下调DOX诱导的Bax蛋白表达，上调Bcl-2蛋白的表达，抑制caspase-3蛋白活性。进一步观察了IGF-1R和IGFBP-3蛋白表达，发现心肌肽可改变DOX对IGF-1系统的影响，使IGF-1R蛋白表达增加，IGFBP-3蛋白表达减少。以上结果提示，心肌肽可能通过调节IGF-1系统，保护DOX所致的心肌细胞损伤。
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