2. 渭南职业技术学院护理学院,陕西 渭南 714026
2. Nursing College, Weinan Vocational and Technical College, Weinan Shaanxi 714026, China
抗生素耐药性问题变得越来越严重,急需寻求新型抗生素来解决抗生素耐药这一问题。放线菌作为一类重要的微生物药用资源,可产生抗生素、抑制剂、酶等,在医药行业中发挥着重要作用。随着生物技术的不断发展,种类丰富、结构多样的放线菌不断被挖掘出来。在微生物次级代谢产物研究中,现已发现天然生物活性物质中有40%分离自放线菌,其中临床和农业生产中使用的150多种抗生素中,有2/3来自于放线菌[1-2]。作为产生抗生素的最有潜力的生产者,放线菌中的链霉菌受到了极大关注。
普通陆地环境中的土壤是链霉菌获取的重要途径,但是随着人们的不断挖掘,陆地环境内链霉菌的获取率已经越来越低,所以研究者们把研究方向转向了代谢途径特殊的红树林等特殊生境的微生物研究[3],以此来寻求具有特殊生物活性的新型抗生素类化合物。多个红树林淤泥放线菌研究结果显示,链霉菌为红树林淤泥放线菌的多产菌属,丰富的链霉菌种类大大增加了筛选出药用资源的机率。所以本研究地点选择了研究相对较少、物种丰富、污染少的广西茅尾海红树林[4],开展了相关研究。有研究者在此处获得了多样性丰富的放线菌,并且发现了许多具有抑菌活性的放线菌菌株[5]。本文主要对广西茅尾海红树林中获得的3株链霉菌从抗菌活性、系统发育树和生物学特征进行研究,希望通过本研究为寻找具有开发价值的新抗生素提供基础。
1 材料与方法 1.1 材料 1.1.1 样品3株分离自广西茅尾海红树林自然保护区根围淤泥中的链霉菌。
1.1.2 培养基①分离培养基如下:M1(棉子糖组氨酸培养基):棉子糖5 g、KNO3 1 g、L-组氨酸1 g、CaCl2 2 g、NaCl 1 g、MgSO4·7H2O 1 g、K2HPO4 1 g、琼脂20 g、海水600 mL、蒸馏水400 mL,pH 7.2;M2(海藻糖-脯氨酸培养基):海藻糖5 g、脯氨酸1 g、(NH4)2SO4 1 g、NaCl 1 g、CaCl2 2 g、K2HPO4 1 g、MgSO4·7H2O 1 g、复合维生素1 mL、琼脂18 g、土壤浸汁30 mL、海水500 mL、蒸馏水500 mL,pH 7.2;M3[淀粉酪素培养基(筛选嗜盐或耐盐的菌)][6]:可溶性淀粉10 g、干酪素0.3 g、KNO3 2 g、MgSO4·7H2O 0.05 g、NaCl 30 g、K2HPO4 2 g、CaCO3 0.02 g、FeSO4 10 mg、琼脂15 g、土壤浸汁30 mL、蒸馏水1 000 mL,pH 7.2;M4(ISP5培养基):L-天门冬酰胺1 g、甘油10 g、K2HPO4 1 g、微量盐1 mL、琼脂15 g、土壤浸汁30 mL、蒸馏水1 000 mL,pH 7.2。②纯化选用培养基:ISP2固体培养基。③发酵选用培养基:ISP2液体培养基。④药敏试验菌株选用培养基:肠球菌耐药株2800(Enterococcus faecalis)选用BHI培养基培养。Mueller-Hinton(M-H)培养基(英国OXOID)用于培养其他药敏试验菌株。
1.1.3 抑制剂抑制剂分别为放线菌酮50.0 mg·L-1,重铬酸钾25.0 mg·L-1,萘啶酮酸25.0 mg·L-1
1.1.4 药敏试验测试菌株肠球菌耐药株2800,由广东汕头大学提供;铜绿假单胞菌敏感株ATCC27853和耐药株2774、金黄色葡萄球菌敏感株ATCC29213和耐药株ATCC43300、肺炎克雷伯菌敏感株ATCC10031和耐药株ATCC700603、大肠埃希菌敏感株ATCC25922、粪肠球菌敏感株ATCC33186和耐药株VRE310681、鲍曼不动杆菌敏感株ATCC19606和耐药株2799,均由中国医学科学院医药生物技术研究所提供。
1.1.5 试剂与仪器DNA提取用Chelex100树脂,购于美国Bio-Rad公司;2×EasyTaq Supermix、放线菌酮,购于北京全式金生物技术有限公司;萘啶酮酸与PCR引物(27F, 1492R),购于上海生工生物工程有限公司;其他试剂均为国产分析纯。Autoclave MLS-3750型高压蒸汽灭菌锅(日本Sanyo公司);PCR扩增仪Veriti96 well fast thermal cycler(美国Applied Biosystems公司);YT-CJ-1ND超净工作台(北京亚泰科隆仪器有限公司);小型离心机Centrifuge1-14(德国Sigma公司);旋转蒸发仪OSB-2100(日本EYELA公司);电泳仪DYY-6C(北京市六一仪器厂);全恒温培养箱ZDP-2120、旋转式摇床ZHWY111C(上海智城分析仪器制造有限公司)。
1.2 方法 1.2.1 土样制备参考吴越等[7]的土壤处理方式,将新鲜海泥放于无菌平皿中,室温条件超净台内自然风干后,用无菌研钵将干泥块研磨成细粉末状。分别称取5 g不同地点的粉末,于45 mL(含有无菌玻璃珠)无菌水中溶解,180 r·min-1、28 ℃摇床振荡6 h;吸取1 mL土样溶解悬液于9 mL无菌水中,然后稀释成4个梯度,分别为100、10、1、0.1 g·L-1,选择终浓度为10、1、0.1 g·L-1,分别吸取0.2 mL于4种不同分离培养基平皿上,进行涂布,完成后,置28 ℃恒温培养箱培养,定期观察平板内菌落的生长情况。
1.2.2 菌株的分离与保存连续培养2~8周后,观察菌落的形态及生长情况。肉眼判断观察后,挑取形态似放线菌的菌落,用竹签挑取单个菌落于改良ISP2固体培养基,并三区划线,以得到纯化的单菌落。同时,将菌株以无菌的20%甘油作为保护剂, 置于-80 ℃冰箱保存,以20%无菌脱脂牛奶作为保护剂,冷冻干燥后,置4 ℃冰箱保藏。
1.2.3 16SrRNA基因序列的测定和系统发育学分析①采取Chelex-100法提取基因组DNA[8]。扩增引物为通用引物27F(5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′)和1492R(5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′)。总体积为50 μL的PCR反应体系:27F(10 μmol·L-1)1.5 μL,1492R(10 μmol·L-1)1.5 μL,模板2.5 μL,2×Easy taq supermix 25 μL,无菌水19.5 μL。PCR反应条件为:95 ℃预变性5 min;94 ℃变性1 min,55 ℃退火1 min,72 ℃延伸2 min,35个循环;72 ℃后延伸10 min。② PCR产物选用1%琼脂糖凝胶110 V、30 min电泳检测;将筛选出的阳性结果交由生工生物工程(上海)股份有限公司测序。③登录http://www.ezbiocloud.net/identify和NCBI数据库,对测序所获16S rRNA基因序列进行相似性比对。分别选取相似性较高且有效发表菌株的16S rRNA基因序列作为参比对象,然后采用Clustal W进行多序列比对[9],用MEGA 7.0软件[10]通过邻接法(Neighbor-Joining)进行聚类分析,并进行系统进化树[11]的构建,系统进化矩阵根据Kimura-2[12]模型估计,重复取样1 000次进行自展值(Bootstrap value)分析,以此来评估系统进化树拓扑结构的相对稳定性。
1.2.4 发酵粗提物抗菌活性检测 1.2.4.1 检定样品的制备挑取生长3~4 d的菌株,于装有130 mL发酵培养基的500 mL锥形瓶中,接种3瓶,摇床180 r·min-1,温度28 ℃培养6~7 d。培养结束后,将发酵液4 500 r·min-1离心30 min,留取发酵粗提物30 mL到样品瓶中,剩余部分选用等体积的乙酸乙酯萃取,酯相(E1-3)旋蒸浓缩干燥后,用3 mL甲醇溶于样品瓶中备用。留取萃取后的水相(A1-3)60 mL,挥发干燥后,用3 mL 1 :1甲醇水溶液溶解后备用。丙酮浸泡菌体(M)24 h后,采用与水相制备相同的方法。
1.2.4.2 药敏试验测试菌株的配制将平皿上的药敏试验菌株分别接种于装有20 mL MH与BHI液体培养基的100 mL锥形瓶中,摇床设置36 ℃、180 r·min-1培养12 h,将菌悬液按0.8%浓度,加入到温度降至55 ℃左右无菌MH和BHI琼脂培养基中,摇匀,使其终浓度为0.5麦氏浓度单位,以每皿15~20 mL倾倒至培养皿内,置4 ℃冰箱备用。
1.2.4.3 样品抗菌活性筛选选用牛津杯法,将200 μL发酵粗提物加入到含有药敏试验测试菌株的平皿内,36 ℃培养箱培养12~18 h。采取纸片扩散法,将直径为6 mm、厚度为2 mm的圆形无菌滤纸片上,滴加60 μL已制备完成的E、A、M3类样品,待其挥发干燥后,贴于含有测试菌的培养皿上,36 ℃培养箱培养12~24 h后,观察并测量抑菌圈的大小。
2 结果 2.1 抗菌活性利用药敏试验测试菌株对未经浓缩的发酵粗提物采用牛津杯法进行抗菌活性检测,检测结果显示,菌株K51M对金黄色葡萄球菌敏感株与耐药株均具有明显的抑菌作用,抑菌圈大小分别为13.1 mm和9.6 mm(Fig 1),其余两株链霉菌未出现抑菌圈。
将发酵液浓缩后,采用纸片法进行抗菌活性检测。检测结果显示(Tab 1),菌株K57M对金黄色葡萄球菌和铜绿假单胞菌均具有较好的抑菌活性。菌株K131M对大多数药敏菌株产生了明显的抑菌作用,特别是对金黄色葡萄球菌敏感株和铜绿假单胞菌的抑菌活性更强;而菌株K51M对革兰阳性测试菌都表现出了较好的抗菌活性(Fig 2)。
Strain | P.a | E.c | S.a | E.f | K.p | A.b | |||||||||||
S | R | S | R | S | R | S | R | S | R | S | R | ||||||
K57M | - | 9 | - | - | 10.6 | - | - | - | - | - | - | - | |||||
K131M | 18 | 22.3 | 8.7 | 9.9 | 23.6 | 6.3 | 6.2 | - | 13.8 | - | 17.4 | - | |||||
K51M | - | - | - | 7.4 | 17.4 | 16.6 | 11.2 | 14.8 | 12.1 | - | 8.6 | 10.1 | |||||
Gram-positive bacteria (S.a: Staphylococcus aureus, E.f: Enterococcus faecalis); Gram-negative bacteria (P.a: Pseudomonas aeruginosa; E.c: Escherichia coli; K.p: Klebsiella pneumoniae; A.b: Acinetobacter baumannii). S: Sensitive strain; R: Resistant strain. |
经选择培养基培养,3株菌均在改良ISP2培养基上生长良好,并且菌落紧贴培养基生长,干燥、多皱褶,具有典型的放线菌形态。其中K57M菌落开始呈现白色,后逐渐生长为灰白色,布满孢子丝,质地较密,且不易被挑取。K131M质地较密,菌落为黄色,白色孢子丝布满菌落,生长周期较长,极易挑起;K51M菌落开始为灰白色,后面孢子产生孢子丝布满菌落,但孢子丝不易散落,菌落可使培养基着色,观察培养基颜色变化发现产生可溶性灰褐色色素,并且菌落不容易从培养基上挑取(Fig 3)。
2.3 基于16S rRNA构建3株放线菌菌株的系统发育树测序获得3株菌株的16S rRNA基因序列后,登录Ezbiocloud进行序列比对,并构建系统进化树,选取相似性较高的菌株序列作为参比对象(Fig 4)。从比对结果中发现,菌株K57M与菌株Streptomyces polymachus KM229363 T258T的相似率为98.30%,在N-J系统进化树中,与部分有效发表的菌株形成一簇,并且形成了独立的进化分支,说明菌株K57M极有可能为链霉菌属内潜在的新种,接下来将开展多相分类学相关的研究。菌株K51M在系统进化树中发现,其与链霉菌属中的不产色链霉Streptomyces achromogenes AB184109 NBRC 12735T的序列最为相近,相似率为99.09%,初步判断其可能为这个种的变种。菌株K131M比对结果显示其相似率为99.87%,在进化树分支中可信度较高,提示可能为Streptomyces coeruleoprunus下的一个变种。
3 讨论红树林是位于热带与亚热带潮带间的植物群落,物种多样性造就了丰富的微生物资源[13]。目前,红树林活性物质及其代谢产物已经成为研究的热点。放线菌作为红树林生境中一组特殊的微生物群落,从中挖掘到的放线菌新物种越来越多,根据不同生态环境分为植物内生、陆地、海洋放线菌[14]。已有文献报道,从红树林淤泥中筛选得到的的放线菌多于植物内生放线菌[15],其中链霉菌属和小单孢菌属是红树林淤泥放线菌中的优势菌属,并且种类丰富。红树林淤泥放线菌中的优势菌属链霉菌属于高G+C含量的有机化能好氧型革兰阳性放线菌,不仅种类丰富,而且近年来大多数抗菌、抗肿瘤的次级活性产物主要来源于链霉菌。如Yu等[16]从1株来源于厦门红树林的链霉菌属中获得了1个新的大环内酯类化合物,具有抗真菌及抗肿瘤的作用;Zhang等[17]从1株链霉菌中分离获得了2个新化合物,并且检测到对大肠杆菌能够产生较好的抗菌活性。因此,来源于红树林的链霉菌具有潜在的研究及开发价值。
广西茅尾海红树林自然保护区为省级红树林自然保护区,占据着独特的地理环境[18],其红树群落较为简单,主要为桐花树、桐花树-无瓣海桑群落,还有伴生植物-互花米草。此次就广西茅尾海的3株链霉菌进行生物特征研究及活性鉴定,发现这3株菌株的抗菌活性具有一定的对比差异性。首先,菌株K57M在测序比对后,通过构建进化树,初步鉴定为潜在的链霉菌属内的新物种,并且对金黄色葡萄球菌敏感株和铜绿假单胞菌耐药株产生了抑菌活性,说明其抗菌能力较为窄谱;其次,菌株K131M对于药敏试验测试菌株具有广谱抗菌活性,且抑菌活性较好;再者,菌株K51M通过牛津杯试验和纸片法试验,均表现出了较好的抗菌能力,特别是纸片扩散法筛选结果显示,它对于革兰阳性与革兰阴性菌均具有较好的抑菌作用,说明其抗菌能力较为广谱。通过统计可以看出,这3株菌株对金黄色葡萄球菌均产生了较好的抑菌活性,而且在致病菌种类和抗菌能力上均有所不同。这也为我们筛选特异性次级代谢产物提供了一定的基础和微生物来源。
红树林丰富的链霉菌及大量的研究结果表明,该属的次级代谢产物仍然具有巨大的研究潜力。通过对广西茅尾海红树林根围淤泥中放线菌研究发现,其资源丰富,链霉菌种类多样,这不仅为新活性次级代谢产物的筛选提供了微生物资源,同时为微生物来源的新型抗生素的开发提供了基础。
( 致谢: 本实验在中国医学科学院医药生物技术研究所孙承航老师实验室完成,特别感谢实验室老师及同学的指导与帮助!)
[1] |
Bérdy J. Thoughts and facts about antibiotics: where we are now and where we are heading[J]. J Antibiot, 2012, 65(8): 385. doi:10.1038/ja.2012.27 |
[2] |
Berdy J. Bioactive microbial metabolites : a personal view[J]. J Antibiot, 2005, 58(1): 1-26. |
[3] |
洪葵. 红树林放线菌及其天然产物研究进展[J]. 微生物学报, 2013, 53(11): 1131-41. Hong K. Actinomycetes from mangrove and their secondary metabolites[J]. Microbiol Chin, 2013, 53(11): 1131-41. |
[4] |
张忠华, 胡刚, 梁士楚. 广西红树林资源与保护[J]. 海洋环境科学, 2007, 26(3): 77-84. Zhang Z H, Hu G, Liang C S. Mangrove resources and conservation in Guangxi[J]. Mar Environ Sci, 2007, 26(3): 77-84. |
[5] |
吴家法, 吴思婷, 李智鸣, 等. 茅尾海红树林土壤可培养放线菌多样性及其抗尖孢镰刀菌活性分析[J]. 中国抗生素杂志, 2017, 42(4): 294-301. Wu J F, Wu S T, Li Z M, et al. Biodiversity and screening of culturable actinobacteria against Fusarium oxysporum isolated from mangrove soil in Maowei sea[J]. Chin J Antibiot, 2017, 42(4): 294-301. doi:10.3969/j.issn.1001-8689.2017.04.007 |
[6] |
孙婷.高盐极端生境下放线菌的生态分布及拮抗性放线菌资源研究[D].陕西: 西北农林科技大学, 2010. Sun T. Study on ecological distribution actinomcetes and resources of antagonistic actinomycetes in salty environments[D]. Shanxi: J Northwest A&F University, 2010. |
[7] |
吴越, 李小俊, 陈建宏, 等. 两株红树林根际土壤放线菌的鉴定和抗菌活性研究[J]. 中国药理学通报, 2017, 33(6): 813-8. Wu Y, Li X J, Chen J H, et al. Identification and antimicrobial activity research on two actinomycetes isolated from mangrove rhizosphere soils[J]. Chin Pharmacol Bull, 2017, 33(6): 813-8. doi:10.3969/j.issn.1001-1978.2017.06.014 |
[8] |
周双清, 黄小龙, 黄东益, 等. Chelex-100快速提取放线菌DNA作为PCR扩增模板[J]. 生物技术通报, 2010, 24(2): 123-5. Zhou S Q, Huang X L, Huang D Y, et al. A rapid method for extracting DNA from actinomycetes by Chelex-100[J]. Biotechnol Bull, 2010, 24(2): 123-5. |
[9] |
Thompson J D, Higgins D G, Gibson T J. CLUSTAL W: improving the sensitivity of progressive multiple sequence alignment through sequence weighting, position-specific gap penalties and weight matrix choice[C]. Nucleic Acids Res.1994: 4673-80.
|
[10] |
Kumar S, Stecher G, Tamura K. MEGA7: molecular evolutionary genetics analysis version 7.0 for bigger datasets[J]. Mol Biol Evol, 2016, 33(7): 1870. doi:10.1093/molbev/msw054 |
[11] |
Saitou N, Nei M. The neighbor-joining method: a new method for reconstructing phylogenetic trees[J]. Mol Biol Evol, 1987, 4(4): 406-25. |
[12] |
Kimura M. A simple method for estimating evolutionary rates of base substitutions through comparative studies of nucleotide sequences[J]. J Mol Evol, 1980, 16(2): 111-20. doi:10.1007/BF01731581 |
[13] |
Yan B, Hong K, Yu Z N. Archaeal communities in mangrove soil characterized by 16S rRNA gene cones[J]. J Microbiol, 2006, 44(5): 566-71. |
[14] |
阮继生, 黄英.放线菌快速鉴定与系统分类[M].科学出版社, 2011. Ruan J S, Huang Y. Rapid identification and systematic classification of actinomycetes[M].Science Press, 2011. |
[15] |
Hong K, Gao A H, Xie Q Y, et al. Actinomycetes for marine drug discovery isolated from Mangrove soils and plants in China[J]. Mar Drugs, 2009, 7.0(1.0): 24-44.
|
[16] |
Yu H L, Jiang S H, Bu X L, et al. Structural diversity of anti-pancreatic cancer capsimycins identified in mangrove-derived Streptomyces xiamenensis 318 and post-modification via a novel cytochrome P450 monooxygenase[J]. Sci Rep, 2017, 7: 40689. doi:10.1038/srep40689 |
[17] |
Zhang D, Shu C Y, Lian X Y, et al. New antibacterial Bagremycins F and G from the marine-derived Streptomyces sp. ZZ745[J]. Mar Drugs, 2018, 16(330): 1-7. |
[18] |
黄德练, 吴志强, 黄亮亮, 等. 广西钦州港红树林区鱼类物种多样性分析[J]. 海洋湖沼通报, 2013(4): 135-42. Huang D L, Wu Z Q, Huang L L, et al. The fish species diversity analysis in mangrove of Maowei gulf in Qinzhou, Guangxi province[J]. Trans Oceanol Lirnnol, 2013(4): 135-42. |