2. 锦州医科大学 基础医学院药理学教研室，辽宁 锦州 121001
2. Dept of Pharmacology, Jinzhou Medical University, Jinzhou Liaoning 121001, China
糖尿病心肌病(diabetic cardiomyopathy，DCM)是糖尿病(diabetes mellitus，DM)最为常见和严重的慢性并发症之一，其发病率与DM的病程高度相关。大量的研究发现，病史5年的DM患者，其DCM的发生率约为44.4%，8年升高至56%。并且DCM目前已经成为DM患者的主要致死原因之一[1]。研究发现，在长期处于高糖状态下，DM患者的心肌细胞内的糖、脂及蛋白质代谢发生紊乱，进而引起心肌细胞、血管内皮等组织的损伤，最终导致心肌细胞肥大、坏死、心肌间质纤维化等病理学改变[2]。DCM的发病机制目前仍尚不明确，但新近的研究发现，炎性细胞因子转化生长因子β1(transforming growth factor β1，TGF-β1)和结缔组织生长因子(connective tissue growth factor，CTGF)可能在DCM发生及发展中起着重要作用[3]。因此，寻求DCM的治疗药物，已经成为目前研究的热点。然而，国内外尚无安全有效的治疗药物。
研究发现，内分泌-血管活性肽Urocortin(UCN)在多种心血管疾病中发挥治疗和保护作用。UCN是广泛分布于下丘脑、垂体及多种外周器官的神经内分泌活性肽[4]。UCN通过自分泌或旁分泌作用，具有多种生理及药理作用。业已证明，UCN能降低自发性高血压大鼠的血压，具有类似钙通道阻断剂的扩张冠脉血管的作用，并在动脉粥样硬化和心肌缺血/再灌注损伤中发挥重要作用。新近研究也提示，UCN可能在DCM中同样发挥保护作用，能降血压，并且能预防或逆转心肌的病理性重构[5]，但具体作用及机制未见报道。因此，本研究采用DCM大鼠，探讨UCN对DCM大鼠心肌细胞内炎性细胞因子，如TGF-β1和CTGF水平的影响，进一步探讨UCN对DCM保护作用与蛋白激酶B/糖原合成酶激酶3β(Akt/GSK-3β)信号通路的关系，为UCN成为DCM有效治疗药物提供理论依据。
1 材料与方法 1.1 材料 1.1.1 实验动物♂健康Wistar大鼠，50只，体质量(250~300) g，18~20周龄，由上海实验动物中心提供，动物合格证号：SCXK(辽) 2007-0009。饲养条件：温度(20~24) ℃，湿度45%±5%，有充分光照及通风条件，大鼠每笼10只。
1.1.2 药物与试剂Urocortin、Astressin、Triciribine，均购自美国Sigma公司；链脲佐菌素，购自北京博爱港商贸中心；TGF-β1单克隆抗体、p-Akt(Ser473)、Akt、p-GSK-3β(Ser9)、GSK-3β抗体，均购自武汉博士得生物工程有限公司；兔抗鼠CTGF单克隆抗体，购自碧云天生物试剂公司。
1.1.3 仪器AccuCheck血糖检测仪(德国罗氏公司)；IX70型倒置显微镜(日本Olympus公司)；LEICA-RM2135石蜡切片机(德国莱卡公司)。
1.2 动物造模及实验分组选取40只Wistar大鼠，尾静脉注射链脲佐菌素(streptozotocin，STZ)55 mg·kg-1(溶于新鲜配制的0.1 mol·L-1，pH 4.3的柠檬酸钠缓冲液中)，连续给药3 d，诱导DM模型建立。以空腹血糖≥16.7 mmol·L-1，尿糖++++，有多饮、多食、多尿症状的大鼠视为DM大鼠造模成功，每周监测尿糖、血糖以及体质量变化。将实验动物随机分为5组，每组10只大鼠，包括：①空白对照组(Control)，Wistar大鼠给予生理盐水1 mL·kg-1·d-1；②DCM组，DM大鼠给予生理盐水1 mL·kg-1·d-1；③UCN组，DM大鼠给予UCN 10 μg·kg-1·d-1；④UCN与Astressin(CRH-R2阻断剂)组(UCN+AST)，DM大鼠给予UCN 10 μg·kg-1·d-1和Astressin 30 μg·kg-1·d-1；⑤UCN与Triciribine(Akt阻断剂)组(UCN+TRI)，DM大鼠给予UCN 7 μg·kg-1·d-1和Triciribine 0.5 mg·kg-1·d-1。上述各组实验动物均饲养12周后给药，给药途径为腹腔注射，持续给药4周。
1.3 大鼠一般状态、体质量及血糖、尿糖的观察实验期间均不禁食，自由活动，予以充足水及食物。各组实验动物在16周后，用代谢笼收集各组大鼠当日尿量，测定尿糖。每2周测定各组大鼠体质量变化和尾静脉采血监测血糖。
1.4 ELISA法测定血清中TGF-β1和CTGF的水平16周后，20%乌拉坦(1 g·kg-1)麻醉大鼠，成功后每只颈动脉取血2 mL，分别置于EP管中，3 500 r·min-1离心5 min，取上清。ELISA法测血清TGF-β1和CTGF水平。
1.5 大鼠心肌细胞形态学观察血清TGF-β1和CTGF水平测定结束后，将各组实验动物手术打开胸腔，取出心脏，制备心肌组织石蜡切片，苏木素-伊红(HE)染色，在光镜下观察大鼠心肌病理学改变，以确定DCM模型成功。
1.6 Western blot法测定心肌组织TGF-β1、CTGF、Akt、p-Akt、GSK-3β和p-GSK-3β的蛋白表达将每组心肌组织(保存于-80 ℃)各取100 mg，置于5个EP管中，每个EP管各加入裂解液200 μL。剪碎心肌组织后超声粉碎，12 000 r·min-1离心30 min后取上清。应用牛血清白蛋白作为对照，计算各组蛋白含量。上样后，SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，半干法将蛋白质转移至PVDF膜，封闭2 h后，置于一抗中4 ℃孵育过夜。次日TBS冲洗3次(每次4 min)，置于辣根过氧化物酶标记的二抗中，室温孵育1 h，TBS洗膜3次(每次4 min)，将膜置于显色剂中，避光显色3~5 min后拍片，自动分析凝胶图像的软件计算蛋白量。
1.7 统计学分析SPSS 19.0进行统计学分析，数据以x±s表示。多组比较用F检验，两两比较用q检验。
2 结果 2.1 血糖、尿糖及体质量的改变Tab 1结果显示，Control组大鼠血糖(blood glucose，BG)波动在3~6 mmol·L-1之间，尿糖(urinary glucose，UG)阴性(-)。DM大鼠成模后，血糖均超过16.5 mmol·L-1，24 h尿量(urine volume，UV)增多，尿糖均+以上。各组DM大鼠体质量(body weight，BW)均明显下降(P < 0.01)。与DCM组相比，UCN组大鼠体质量增加，差异具有显著性(P < 0.01)。UCN组大鼠血糖和尿糖虽高于Control组，但与DCM组相比，尿糖有所降低(P < 0.05)。UCN组及各实验组血糖与DCM组相比，没有明显下降。
| Group | BG /mmol·L-1 |
UG | UV /mL |
BW /g |
| Control | 4.1±1.1 | - | 13.65±1.32 | 385.0±12.3 |
| DCM | 23.6±3.1** | +++ | 25.29±2.36** | 221.5±15.6** |
| UCN | 21.2±2.2** | +* | 17.54±1.83**## | 298.1±11.7**## |
| UCN+AST | 21.8±3.8** | +++ | 24.88±1.90** | 237.7±16.2** |
| UCN+TRI | 20.3±2.4** | ++ | 23.75±2.59** | 251.8±21.4**# |
| **P < 0.01 vs control; #P < 0.05, ##P < 0.01 vs DCM | ||||
如Fig 1所示，与Control组相比，其它各组大鼠血清TGF-β1和CTGF水平均明显升高(P < 0.05)；与DCM组相比，UCN组大鼠血清TGF-β1和CTGF水平明显下降(P < 0.05)。UCN+AST组大鼠血清TGF-β1、CTGF水平与DCM组相比，差异无显著性(P>0.05)。
|
| Fig 1 Effects of UCN on TGF-β1 and CTGF in plasma of DCM rats(x±s, n=10) *P < 0.05, **P < 0.01 vs control; ##P < 0.01 vs DCM; △P < 0.05 vs UCN |
如Fig 2所示，Control组大鼠心肌细胞形态正常，间质未见明显改变；DCM组大鼠心肌细胞肥大、变性、心肌胶原纤维排列紊乱、炎性细胞浸润，出现坏死，符合DCM病理改变；与DCM组相比，UCN组大鼠心肌病理损伤明显减轻，细胞排列较整齐，有少量炎性细胞浸润；与UCN组相比，UCN+AST和UCN+TRI组大鼠心肌细胞损伤较为明显，心肌细胞肥大，胶原增生、细胞排列紊乱。
|
| Fig 2 Effects of UCN on pathological morphology of myocardial tissue in rats(HE staining×100) A: Control group; B: DCM group; C: UCN group; D: UCN+Astressin group; E: UCN+Triciribine group |
如Fig 3所示，与Control组相比，DCM组大鼠心肌组织TGF-β1和CTGF表达水平明显升高(P < 0.01)；与DCM组相比，UCN组大鼠心肌组织TGF-β1和CTGF的表达水平明显下降(P < 0.05)；与DCM组相比，UCN+AST组大鼠心肌组织TGF-β1和CTGF表达水平差异无显著性(P>0.05)。
|
| Fig 3 Effects of UCN on TGF-β1 and CTGF expression in DCM rats(x±s, n=10) *P < 0.05, **P < 0.01 vs control; ##P < 0.01 vs DCM; △P < 0.05 vs UCN |
如Fig 4所示，与Control组相比，DCM组大鼠心肌组织p-Akt和p-GSK-3β表达水平明显降低(P < 0.01)；与DCM组相比，UCN组大鼠心肌组织p-Akt和p-GSK-3β的表达水平明显升高(P < 0.05)。UCN+AST组大鼠心肌组织p-Akt和p-GSK-3β表达水平与DCM组相比，差异无显著性(P>0.05)。
|
| Fig 4 Effects of UCN on p-Akt/Akt and p-GSK-3β/GSK-3β in DCM rats(x±s, n=10) *P < 0.05, **P < 0.01 vs control; ##P < 0.01 vs DCM |
本实验中，DM大鼠饲养16周后，三多一少症状明显，死亡鼠增加，出现白内障、失明等情况，表明DM大鼠出现微血管并发症，提示DM大鼠可能发生DCM病变。HE染色显示：DM大鼠心肌细胞肥大坏死，心肌肌原纤维不规则排列，出现炎性细胞浸润，成功制备DCM模型。DCM是独立的心脏病变，其发病机制可能包括物质能量代谢障碍、心肌间质纤维化、心脏副交感神经调节受损及心脏微小血管病变等。DCM尚无有效的防治方法，控制血糖、血压、血脂及改善心脏功能是目前主要的治疗原则。
在实验中，我们发现DCM组大鼠血清及心肌组织中TGF-β1和CTGF水平明显升高，UCN能明显降低DCM组大鼠血清及心肌组织中的TGF-β1和CTGF水平。CTGF是一种由349个氨基酸组成的富含半胱氨酸的肝素结合肽，目前已证明，心脏、肺脏、肝脏、肾脏和结缔组织中广泛地存在CTGF的表达[6]。多种脏器的纤维化与CTGF在该脏器的高表达密切相关，并能触发与纤维化有关的，如细胞增殖、黏附、迁移和细胞外基质合成等细胞变化，长期过度表达能明显促进纤维化的发生和发展[7]。多种细胞因子可以调控CTGF的表达，其中TGF-β1是诱导CTGF表达的最为重要的因素之一[8]。TGF-β1对细胞生长分化、细胞外基质沉积具有潜在作用，是体内最有力的促纤维化生长因子之一，是促进肺脏、肝脏、肾脏等多种脏器纤维化的关键因子之一[9]。TGF-β1反应元件存在于CTGF基因启动子序列中，调控成纤维细胞中CTGF的表达[10]。在DCM发生、发展中，TGF-β1和CTGF起着非常重要的作用[11]。活化的TGF-β1促进纤维细胞合成胶原纤维、纤维黏连蛋白和蛋白多糖，加剧组织纤维化；活化的TGF-β1还能诱导蛋白水解酶抑制物的合成，抑制蛋白水解酶的表达，并且抑制纤溶酶原、胶原酶、基质酶酶原激活物的产生。DM大鼠心室肌细胞CTGF表达明显增加，并随病程持续升高，细胞外基质蛋白合成加速，成纤维细胞合成胶原蛋白增加，心肌细胞肥大[12]。肥厚和纤维化的心肌组织中TGF-β1表达明显增多，其可促进心肌细胞肥大，刺激成纤维细胞分泌胶原增多，促进细胞外基质的合成，抑制其降解[3]。本实验发现，与DCM组相比，UCN组大鼠血清及心肌组织中的TGF-β1和CTGF水平明显下降，提示UCN可通过降低DCM大鼠TGF-β1和CTGF水平，抑制致心肌纤维化的重要炎症因子的生成，最终对DCM起治疗作用。
实验中发现，DCM组大鼠心肌组织p-Akt和p-GSK-3β表达水平明显降低，给予UCN后，p-Akt和p-GSK-3β的表达水平明显升高。Akt是磷脂酸肌醇-3-激酶(phosphatidylinositol-3-kinase，PI3K)下游的重要信号分子，参与调节细胞的分裂、分化、生长、代谢以及凋亡等一系列生理及病理过程[13]。GSK-3β是Akt重要的下游底物之一，活化的Akt能与GSK-3β结合，诱导GSK-3β向细胞膜转位，磷酸化其N端的Ser9活性位点，并使之失活[14]。Akt/GSK-3β通路受损与胰岛素抵抗相关性疾病，如2型DM、糖尿病肾病、心血管疾病等密切相关[15]。在本实验中，DCM大鼠心肌细胞p-Akt和p-GSK-3β表达明显降低，表明Akt/GSK-3β信号通路参与了DCM的发生、发展，UCN能明显增强DCM大鼠心肌组织p-Akt和p-GSK-3β的表达，提示UCN对DCM的保护及治疗作用与Akt/GSK-3β信号通路关系密切。
在实验中，我们发现UCN能明显抑制DM大鼠心肌细胞TGF-β1和CTGF的表达，激活Akt/GSK-3β信号途径。此外，UCN对高血糖导致的心肌损害的保护作用能被CRH-R2阻断剂(Astressin)所抑制，Akt阻断剂(Triciribine)也部分抑制UCN对DCM的作用，UCN促Akt和GSK-3β磷酸化的作用也被Astressin抑制。UCN主要与CRH-R结合后发挥生物学作用[16]。UCN具有强大的心血管保护作用，能抑制心肌缺血/再灌注所导致的心肌细胞凋亡；扩张冠状动脉，保证心肌自身的血液供应，逆转心肌缺血导致的心肌坏死[17]。以上结果提示，UCN对DCM心肌的保护作用可能通过CRH-R2介导激活Akt/GSK-3β信号通路实现的。
综上所述，UCN对DCM具有保护作用，其机制可能与UCN磷酸化Akt和GSK-3β，激活Akt/GSK-3β信号通路，抑制TGF-β1和CTGF的表达有关，但具体机制仍有待进一步的探究。
| [1] |
Tate M, Grieve D J, Ritchie R H. Are targeted therapies for diabetic cardiomyopathy on the horizon[J]. Clin Sci(Lond), 2017, 131(10): 897-915. doi:10.1042/CS20160491 |
| [2] |
Guo R, Nair S. Role of microRNA in diabetic cardiomyopathy: from mechanism to intervention[J]. Biochim Biophys Acta Mol Basis Dis, 2017, 1863(8): 2070-7. doi:10.1016/j.bbadis.2017.03.013 |
| [3] |
Sukumaran V, Tsuchimochi H, Tatsumi E, et al. Azilsartan ameliorates diabetic cardiomyopathy in young db/db mice through the modulation of ACE-2/ANG 1-7/Mas receptor cascade[J]. Biochem Pharmacol, 2017, 144: 90-9. |
| [4] |
Stirrat C G, Venkatasubramanian S, Pawade T, et al. Cardiovascular effects of urocortin 2 and urocortin 3 in patients with chronic heart failure[J]. Br J Clin Pharmacol, 2016, 82(4): 974-82. doi:10.1111/bcp.13033 |
| [5] |
Monteiro-Pinto C, Mulvaney E P, Reid H M, et al. Urocortin-2 improves right ventricular function and attenuates pulmonary arterial hypertension[J]. Cardiovasc Res, 2018, 114(8): 1165-77. doi:10.1093/cvr/cvy076 |
| [6] |
Gauer S, Holzmann Y, Kränzlin B, et al. CTGF is expressed during cystic remodeling in the PKD/Mhm (cy/+) rat model for autosomal-dominant polycystic kidney disease (ADPKD)[J]. J Histochem Cytochem, 2017, 65(12): 743-55. doi:10.1369/0022155417735513 |
| [7] |
Ren Y, Du C, Shi Y, et al. The Sirt1 activator, SRT1720, attenuates renal fibrosis by inhibiting CTGF and oxidative stress[J]. Int J Mol Med, 2017, 39(5): 1317-24. doi:10.3892/ijmm.2017.2931 |
| [8] |
Cheng J C, Chang H M, Leung P C K. Connective tissue growth factor mediates TGF-β1-induced low-grade serous ovarian tumor cell apoptosis[J]. Oncotarget, 2017, 8(49): 85224-33. |
| [9] |
Delaney K, Kasprzycka P, Ciemerych M A. The role of TGF-β1 during skeletal muscle regeneration[J]. Cell Biol Int, 2017, 41(7): 706-15. doi:10.1002/cbin.v41.7 |
| [10] |
Chen J T, Wang C Y, Chen M H. Curcumin inhibits TGF-β1-induced connective tissue growth factor expression through the interruption of Smad2 signaling in human gingival fibroblasts[J]. J Formos Med Assoc. |
| [11] |
Liu X, Liu C, Li J, et al. Urocortin attenuates myocardial fibrosis in diabetic rats via the Akt/GSK-3β signaling pathway[J]. Endocr Res, 2016, 41(2): 148-57. doi:10.3109/07435800.2015.1094489 |
| [12] |
柯旋, 李宾公, 郝艳琴, 等. Vaspin在糖尿病心肌病中的作用及机制研究[J]. 中国药理学通报, 2018, 34(10): 1403-8. Ke X, Li B G, Hao Y Q, et al. Role and mechanism of vaspin in diabetic cardiomyopathy[J]. Chin Pharmacol Bull, 2018, 34(10): 1403-8. doi:10.3969/j.issn.1001-1978.2018.10.015 |
| [13] |
Ersahin T, Tuncbag N, Cetin-Atalay R. The PI3K/AKT/mTOR interactive pathway[J]. Mol Biosyst, 2015, 11(7): 1946-54. doi:10.1039/C5MB00101C |
| [14] |
Wang Y, Yang R, Gu J, et al. Cross talk between PI3K-AKT-GSK-3β and PP2A pathways determines tau hyperphosphorylation[J]. Neurobiol Aging, 2015, 36(1): 188-200. doi:10.1016/j.neurobiolaging.2014.07.035 |
| [15] |
Zhang Y, Huang N Q, Yan F, et al. Diabetes mellitus and Alzheimer's disease: GSK-3β as a potential link[J]. Behav Brain Res, 2018, 339: 57-65. doi:10.1016/j.bbr.2017.11.015 |
| [16] |
Karteris E, Vatish M, Hillhouse E W J, et al. Preeclampsia is associated with impaired regulation of the placental nitric oxide-cyclic guanosine monophosphate pathway by corticotropin-releasing hormone (CRH) and CRH-related peptides[J]. Clin Endocrinol Metab, 2005, 90(6): 3680-7. doi:10.1210/jc.2004-2210 |
| [17] |
Lai N C, Gao M H, Giamouridis D, et al. Intravenous AAV8 encoding urocortin-2 increases function of the failing heart in mice[J]. Hum Gene Ther, 2015, 26(6): 347-56. doi:10.1089/hum.2014.157 |