脑卒中，中医又称为脑中风，是脑血管疾病中最为严重的并发症，是由脑部血管突然破裂或因血管阻塞导致血液不能流入大脑而引起的脑组织损伤，包括缺血性和出血性卒中。目前，获得美国FDA临床应用批件的药物只有组织型纤维蛋白溶活剂，但是其存在治疗“时间窗”窄(发病4.5 h之内治疗有效)和仅对3%~5%的脑卒中病人有治疗效果的缺点[1]。因此，近年来对脑卒中的药物研究已成为热点。
中药红景天是景天科红景天属植物高山红景天(Rhodiold rosea L.)的干燥根茎，具有益气活血、治疗胸痹心痛、中风偏瘫等功效。红景天苷(salidroside，Sal)是药物红景天的主要有效提取物，本实验室前期研究发现，红景天苷对大脑中动脉闭塞(middle cerebral artery occlusion，MCAO)模型大鼠具有神经保护作用[2-5]。补体系统是固有免疫的重要组成部分，通过经典途径、旁路途径及甘露糖结合凝集素(mannose binding lectin，MBL)途径激活，而补体C3处于两条激活途径的汇合点，并为替代途径激活的关键分子，在补体系统的激活中发挥重要作用。补体系统在脑缺血/再灌注后过度激活，导致白细胞大量聚集和激活，造成组织和血管严重损伤[6]。研究认为，补体系统过度激活的炎症效应片段是脑内炎症反应损伤的主要始动因素之一[7]。本文主要研究红景天苷抑制补体成分，对MCAO大鼠的神经保护作用，探讨红景天苷的作用机制。
1 材料 1.1 实验动物SPF级健康♀ SD大鼠45只，体质量(260~280) g，购于上海斯莱克实验动物有限公司，合格证号：2015000510392，许可证号：SCXK(沪)2012-0002。于福建中医药大学实验动物中心饲养，许可证号：SYXK(闽)2014-0005。
1.2 药物与试剂红景天苷(福建中医药大学，纯度≥98%，批号：20151201)；Bax抗体(货号：#2772)、Bcl-xl抗体(货号：#2762)、COX IV(货号：#4850)，均购自Cell Signaling Technology公司；β-actin抗体(货号：H015)、组织线粒体分离试剂盒(产品编号：C3606)，均购自碧云天生物技术有限公司；FITC标记羊抗鼠IgG(货号：ab7064)、TRITC标记羊抗兔IgG(货号：ab6718)、神经元特异性核蛋白(neuron specific nuclear protein，NeuN)抗体(货号：ab104224)，均购自美国Abcam公司；SYBR Select Master Mix(美国Applied Biosystem公司，批号：4472908)；C3抗体(生工生物工程上海有限公司，货号：AB51005)；RNeasyⓇ Mini Kit(Qiagen公司，货号：74134)；cDNA逆转录试剂盒(美国Thermo公司，货号：K1622)。
1.3 仪器倒置荧光显微镜(德国Leica公司)；7900H-PCR仪(美国Applied Biosystems公司)；小型垂直电泳槽、小型转印槽、基础电泳仪电源、ChemiDoc XRS+凝胶成像分析系统(美国Bio-Rad公司)；石蜡切片机、生物组织石蜡包埋机(湖北孝感亚光医用电子有限公司)；ND2000C紫外可见分光光度计(美国Thermo公司)；激光共聚焦显微镜(德国Zeiss公司)；3600AAA尼龙线栓(广州佳灵生物技术有限公司)；Nikon DS-Ril生物数码显微镜(尼康仪器有限公司)。
2 方法 2.1 实验动物分组与给药SD大鼠随机分为假手术组(Sham)、模型组(MCAO)、红景天苷给药组(MCAO+Sal)，每组15只大鼠。造模2 h后，给药组腹腔注射药物(50 mg·kg-1·d-1)，其余组注射0.9%生理盐水(10 mL·kg-1·d-1)，连续给药6 d。
2.2 MCAO模型制备大鼠用2%戊巴比妥钠(2 mL·kg-1)腹腔注射麻醉后，分离左侧颈总动脉(common carotid artery，CCA)、颈外动脉(external carotid artery，ECA)、颈内动脉(internal carotid artery，ICA)，结扎CCA、ECA。动脉夹夹闭ICA，用眼科剪在CCA血管壁上剪一小口，插入线栓至大脑中动脉起始端。2 h后，将线栓抽出并结扎开口，实现再灌注，假手术组不进行插线栓操作[8]。参考Zea-Longa的5级4分法[9]进行神经功能评分，评分≥2分的实验动物为模型制备成功，用于后续实验。
2.3 大鼠基因芯片检测大鼠基因芯片由上海康成生物技术有限公司检测。
2.4 qPCR检测C1qa、C1qb、C1qc、C2、C3、C3a、C4a、C5ar、Cfh、Cfd mRNA表达取大脑组织，根据RNeasyⓇ Mini Kit试剂盒说明，提取总RNA；根据cDNA逆转录试剂盒，采用二步法将RNA逆转录成cDNA，用qPCR检测C1qa、C1qb、C1qc、C2、C3、C3a、C4a、C5ar、Cfh、Cfd mRNA表达水平，PCR引物由生工生物工程上海有限公司合成，以GAPDH为内参计算2-ΔΔCt值。引物序列见Tab 1。
| Gene | Forward primer | Reverse primer |
| C1qa | 5′-AAAGGCAATCCAGGCAATATCA-3′ | 5′-TGGTTCTGGTATGGACTCTCC-3′ |
| C1qb | 5′-CGTCGGCCCTAAGGGTACT- 3′ | 5′-GGGGCTGTTGATGGTCCTC-3′ |
| C1qc | 5′-AGAAGCACCAGTCGGTATTCA-3′ | 5′-TGCGATGTGTAGTAGACGAAGTA-3′ |
| C2 | 5′-CTATCTGCTGCTTGATGCCTCTC-3′ | 5′-TAGCTACGCTGACCTTTATCTCGAA-3′ |
| C3 | 5′-AAAATGGAATCTCTACGAAGGTCA-3′ | 5′-AGTCGCAGGTCAATGAAGAAGTC-3′ |
| C3a | 5′-CAGTTCTGTCTTCCTACTGCCTC-3′ | 5′-CGTTATTCACTTGACTGCCAGG-3′ |
| C4a | 5′-TGAGACCAAGATCACCCAAGTCC-3′ | 5′-CGTCCATCCCCATGATTAAGTA- 3′ |
| C5ar | 5′-ACAGGGGTGATATTAGCTTGGCT-3′ | 5′-GTTTCGTATGATGCTGGGGAGTG-3′ |
| Cfh | 5′-CTCTGTCCAGTTATCTGTCCCTC-3′ | 5′-CATCTATGCCAGTTGACTTCGG-3′ |
| Cfd | 5′-CCAGTCCTGAACCCTACAAGCA-3′ | 5′-TGAGGCATTGTGGGAGAGCTTA -3′ |
取新鲜动物组织，用剪刀把组织剪切成细小碎片。加入800 μL临用前添加了PMSF的线粒体分离试剂A，进行匀浆，以上操作均在冰上进行。匀浆后，4 ℃离心5 min。将上清转移到另一离心管中，再4 ℃离心10 min。小心去除上清，沉淀即为分离得到的线粒体。加入200 μL临用前添加了PMSF的线粒体裂解液裂解线粒体，即得线粒体蛋白。
2.6 Western blot检测Bax、Bcl-xl、C3蛋白的表达提取总蛋白，采用SDS-PAGE凝胶电泳，然后将蛋白转至PVDF膜，用5% BSA封闭2 h后孵育一抗，加入一抗C3(1 :600)、β-actin(1 :3 000)，4 ℃孵育过夜。摇床室温孵育二抗2 h。PVDF膜用TBST洗涤10 min×3次后，加ECL显色剂，采用凝胶成像系统检测，以COX Ⅳ或β-actin为内参，分析目的条带/对应内参的相对表达量。
2.7 免疫组织荧光(IF)染色测定脑组织中C3、NeuN的表达大鼠连续给药6 d后，2%戊巴比妥钠(2 mL·kg-1)麻醉，打开胸腔，暴露心脏，于心尖处插入滞留针至主动脉，剪开右心耳，立即灌注生理盐水，通过体循环流出右心耳，直至流出液体无颜色，再灌注4%多聚甲醛至大鼠四肢僵硬，然后迅速取脑组织置4%多聚甲醛中固定24 h。使用脑膜具将全脑冠状均等分成6片，进行脱水、石蜡包埋及切片。脑组织切片进行荧光染色后，使用激光共聚焦显微镜观察。
2.8 统计学分析结果用x±s表示，用SPSS 20.0统计软件进行统计学处理，各组间数据比较采用t检验和单因素方差分析(one-way ANOVA)。
3 结果 3.1 红景天苷对MCAO大鼠缺血侧脑组织基因表达图谱的影响采用基因芯片方法分析脑组织基因表达图谱发现，缺血/再灌注的MCAO模型大鼠，经红景天苷连续作用6 d后，能够抑制与补体系统相关的基因表达，基因芯片结果已存放在开放数据库NCBI GEO:GSE52001，见Fig 1。
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| Fig 1 Cluster analysis of salidroside treatment and neuroprotective gene expression differences in MCAO rats Each sample is the difference in gene expression between ischemic brain gene expression levels minus sham-operated mean values. The depth of color (red and green represent increase and decrease) indicates the difference in gene expression levels compared with sham |
MCAO模型大鼠再灌注2 h后，连续给药6 d，与Sham组比较，MCAO模型大鼠缺血侧C1qa、C1qb、C1qc、C2、C3、C3a、C4a、C5ar、Cfh、Cfd mRNA表达增加；经红景天苷作用后，能够抑制C1qa、C1qb、C1qc、C2、C3、C3a、C4a、C5ar、Cfh、Cfd mRNA的表达，且差异有统计学意义(P < 0.05)。见Fig 2。
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| Fig 2 Effects of salidroside treatment on C1qa, C1qb, C1qc, C2, C3 mRNA(A) and C3a, C4a, C5ar, Cfh, Cfd mRNA(B) in MCAO rats(x±s, n=3) ##P < 0.01 vs sham; *P < 0.05, **P < 0.01 vs MCAO |
MCAO模型大鼠再灌注1 h后，连续给药6 d，如Fig 3所示，与Sham组比较，MCAO模型大鼠缺血侧线粒体中Bax的蛋白表达升高，Bcl-xl蛋白表达降低；经红景天苷连续作用6 d后，明显降低线粒体中Bax的蛋白表达，升高Bcl-xl的蛋白表达，且差异有统计学意义(P < 0.05)。
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| Fig 3 Effects of salidroside treatment on Bax and Bcl-xl protein in MCAO rats(x±s, n=3) ##P < 0.01 vs sham; **P < 0.01 vs MCAO |
补体成分C3是补体系统3条激活途径中的核心成分，具有重要作用。Fig 4的Western blot结果显示，与Sham组比较，MCAO模型大鼠缺血侧补体成分C3蛋白表达增加，经红景天苷作用后，能够抑制补体成分C3蛋白表达(P < 0.05)。
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| Fig 4 Effects of salidroside treatment on C3 protein in MCAO rats(x±s, n=3) ##P < 0.01 vs sham; **P < 0.01 vs MCAO |
Fig 5的免疫组织荧光染色结果表明，与Sham组比较，MCAO组大鼠C3的荧光信号强度增加，NeuN的荧光信号强度降低，且差异具有统计学意义(P < 0.05)；经红景天苷作用后，C3的荧光信号强度降低，同时NeuN的荧光信号强度增强(P < 0.05)。
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| Fig 5 Salidroside reduced C3 and increased NeuN in peri-infarcted area (×400)(x±s, n=3) ##P < 0.01 vs sham; **P < 0.01 vs MCAO |
本实验采用线栓法制备MCAO大鼠，该方法简单可控、不需要开颅，对动物损伤小、可以控制缺血与再灌注时间[10]，并且可以较准确地模拟临床上脑缺血病况，是研究缺血性脑卒中的经典动物模型[11]。课题组前期研究发现，红景天苷能够降低脑梗死体积，改善神经功能损伤[2-5]。为进一步研究红景天苷的作用机制，本实验以红景天苷(50 mg·kg-1·d-1)作为研究剂量，经Western blot检测发现，红景天苷能够明显降低由MCAO引起的促凋亡蛋白Bax的表达，明显促进抗凋亡蛋白Bcl-xl的表达，表明红景天苷抑制神经细胞凋亡与Bax/Bcl-xl有关。
课题组采用基因芯片方法分析脑组织基因表达图谱，分析发现红景天苷能够抑制与炎症反应、补体系统相关的基因表达，进一步采用qPCR检测C1q、C2、C4a等基因表达，确认红景天苷能够抑制其基因表达。补体激活被认为是调控组织促发炎症进一步损伤的关键因素[12]，抑制补体成分能够有效减轻脑缺血/再灌注的损伤[5]。补体成分C3处于补体激活途径的汇合点，并为替代途径激活的关键分子，在补体系统的激活中发挥重要作用。本实验免疫荧光染色结果显示，补体成分C3在神经细胞中表达，此结果与文献报道的补体的生物合成也发生在大脑中相吻合[13]。同时，本研究发现红景天苷能够抑制补体成分C3的表达，促进神经细胞标志物NeuN的表达，该结果提示，红景天苷能够抑制C3，降低补体系统的过度激活，抑制炎症的发生，减少炎症对脑组织的再次损伤，减少神经细胞的死亡，从而起神经保护作用。
本实验研究发现，红景天苷能够抑制补体中枢成分C3的表达，为本课题组进一步研究红景天苷对补体途径的作用机制奠定理论和实验基础。
( 致谢: 本实验在福建中医药大学药学院生物医药研发中心及省级中药学重点实验室完成，感谢所有老师及同学的支持与帮助！)
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