2. 阜外华中心血管病医院药学部临床药理室，河南 郑州 451464;
3. 河南牧业经济学院食品与生物工程学院，河南 郑州 450011
2. Pharmacy Dept, Fuwai Centeral China Cardiovascular Hospital, Zhengzhou 451464, China;
3. College of Food and Biological Engineering, Henan University of Animal Husbandry and Economy, Zhengzhou 450011, China
食管癌恶性程度高，临床中多进行手术、放化疗等综合治疗手段，但由于其复发及转移特性，目前死亡率仍然较高。据《2017中国肿瘤登记年报》，全国范围内食管癌发病率及死亡率均居前五位。由此可见，研发新的高效、低毒的抗食管癌药物仍然十分迫切。天然对映贝壳杉烷型二萜具有广泛的生物活性，例如抗炎、抗菌、抗病毒、抗肿瘤等，是很有潜力的先导化合物[1]。以往的报道已表明该类化合物具有广谱的体外抗肿瘤活性，但体内活性研究多采用联合用药，以增加现有化疗药物的敏感性，缺乏直接的效果。因此，研究人员对该类天然二萜结构做了大量的改造工作[2]，以期获得活性更高、毒性更低、性质更为稳定的抗肿瘤候选药物。本课题组以天然贝壳杉烷型二萜Jaridonin[3]为先导，利用“药物拼合原理”引入了三氮唑活性结构单元，得到了活性更好的衍生物Jar-TTA(结构见Fig 1A)，其结构新颖、性质稳定，且具有双重抑制糖酵解/氧化磷酸化(oxidative phosphorylation，OXPHOS)的独特功能，国内外尚无任何相关报道，具有开发自主知识产权抗癌药物的重要价值。
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| Fig 1 Effect of Jar-TTA on EC109 and KYSE-150 cell proliferation(x±s, n=6) A: The molecular structural formula of Jar-TTA; B: Effect of Jar-TTA on cell proliferation. 5-Fuorouracil(5-FU) was used as positive control.**P < 0.01 vs control.1:0.00;2:0.75;3:1.50;4:3.00;5:6.00;6:12.00;7:24.00;8:5-FU 24.00 |
有氧糖酵解(Warburg效应)被认为是肿瘤代谢的特征，该特征也为肿瘤药物的开发提供了理想靶点，为肿瘤治疗带来希望[4]。然而，现代肿瘤研究已经证明，肿瘤细胞的代谢呈现出明显的异质性及代谢灵活性，糖酵解并不是肿瘤细胞获取能量的唯一方式[5]。当糖酵解受到抑制时，肿瘤细胞可能会切换为氧化磷酸化的代谢模式为其供能，并且在高侵袭性肿瘤中以及肿瘤干细胞中，OXPHOS甚至发挥着主要作用[5-6]。因此，研发具有糖酵解/OXPHOS双重抑制功能的药物是更具潜力的抗肿瘤策略。本实验则以食管癌细胞为模型，深入研究了Jar-TTA双重抑制糖酵解/OXPHOS的作用及可能的分子机制，为新型抗肿瘤药物的开发提供实验依据。
1 材料 1.1 试剂四氮唑蓝(MTT，美国Sigma公司)；糖酵解压力检测试剂盒、线粒体压力检测试剂盒，均购自美国Seahorse Bioscience公司；FITC-AnnexinⅤ/PI细胞凋亡检测试剂盒(美国Biovision公司)；线粒体荧光染料JC-1和Hoechst 33258，购自江苏碧云天生物技术研究所；荧光葡萄糖类似物2-NBDG为Invitrogen品牌产品；GAPDH抗体(杭州贤至生物科技公司)；葡萄糖转运蛋白4(glucose transporter type 4，GLUT4)、乳酸脱氢酶A(lactate dehydrogenase A，LDHA)抗体，购自美国SAB公司；化学发光检测试剂盒(美国Pierce公司)；胎牛血清(FBS，杭州四季青公司)；RPMI 1640培养基(美国Gibco公司)。
1.2 化合物二萜衍生物Jar-TTA由郑州大学新药研发中心研制，结构经NMR、MS及IR光谱确证，纯度不小于99%。使用DMSO溶解Jar-TTA，配制成24 mmol·L-1的储备液，-20 ℃分装保存。使用前，储备液至少稀释1 000倍，从而确保培养基中DMSO终含量不超过0.1%，以排除DMSO对细胞生长的影响。
1.3 仪器三气细胞培养箱(美国Thermo Fisher Scientific公司)；全波长多功能酶标仪(美国Perkinelmer公司)；高速冷冻离心机(德国Eppendorf公司)；正置荧光显微镜(日本Nikon公司)；生物能量分析仪Seahorse XFp(美国Seahorse Bioscience公司)；流式细胞仪(美国BD公司)。
2 方法 2.1 细胞培养人食管癌细胞株EC109和KYSE-150, 购自中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库，由本实验室传代液氮保存。在37 ℃、5% CO2的培养条件下，使用含有10%胎牛血清、100 g·L-1链霉素和1×105 kU·L-1青霉素的RPMI 1640培养液培养上述细胞。
2.2 细胞生存率测定根据文献所述方法[7]，接种EC109、KYSE-150细胞，培养贴壁后，加入终浓度为0.75、1.5、3、6、12、24 μmol·L-1的Jar-TTA，作用48 h，每孔加入20 μL MTT溶液(质量终浓度为0.5 g·L-1)，培养箱内继续孵育4 h后终止培养，DMSO充分溶解紫色结晶物，使用酶标仪于490 nm处测定吸光度，计算细胞生存率(survival rate)及IC50值。
2.3 线粒体膜电位观察及定量分析细胞接种于6孔板，贴壁培养后，使用0、4、8 μmol·L-1的Jar-TTA分别作用细胞24 h，胰酶消化，EP管离心收集细胞。每管样品加入100 μL JC-1溶液(质量浓度为10 mg·L-1)，于细胞培养箱中孵育20 min，预冷PBS洗涤2次，调整细胞浓度，吸取50~100 μL的待检样品滴至载玻片，加上盖玻片后，荧光显微镜观察并拍照。同时，相同培养条件下，Jar-TTA作用EC109细胞24 h后，离心收集细胞，每管样品加入500 μL上述JC-1溶液，进行同样的染色处理后，通过流式细胞仪每个样品收集10 000个有效细胞，使用Flow Jo软件对线粒体膜电位变化进行定量分析。
2.4 细胞凋亡检测将EC109细胞接种于6孔板，贴壁培养后，0、2、4、8 μmol·L-1的Jar-TTA作用于细胞24 h，离心收集每孔中包括悬浮细胞在内的所有细胞，按照凋亡检测试剂盒说明书进行细胞双染，利用流式细胞仪每个样品收集20 000个有效细胞，使用Flow Jo软件分析凋亡情况。
2.5 能量代谢分析仪检测Jar-TTA对细胞能量代谢的调控作用以每孔7 000个细胞的密度将EC109细胞接种到Seahorse XFp专用板，过夜培养，待细胞进入对数生长期，分别以0、4、8 μmol·L-1 Jar-TTA预孵育EC109细胞2 h后，更换能量分析专用培养液，按照糖酵解/线粒体压力试剂盒说明书配制试剂，并实时检测线粒体耗氧率(oxygen consumption rate，OCR)和代表糖酵解的胞外酸化率(extracellular acidification rate，ECAR)。并根据OCR和ECAR值，分别考察Jar-TTA对EC109细胞的基础有氧呼吸(basal respiration)、最大有氧呼吸能力(maximal respiration)、ATP生成(ATP production)，以及糖酵解水平(glycolysis)、最大糖酵解能力(glycolytic capacity)的影响。其中，象征线粒体OXPHOS有关参数的计算公式如下：Basal respiration=(第1次注射药物前的最后一个检测值)-(非线粒体呼吸耗氧率)；Maximal Respiration=(FCCP注射后最大检测值)-(非线粒体呼吸耗氧率)；ATP Pro-duction= (寡霉素注射前最后一个检测值)-(寡霉素注射后最小检测值)，具体示意图参见Fig 3B。细胞糖酵解水平有关参数公式：Glycolysis=(寡霉素注射前最大检测值)-(葡萄糖注射前最后一个检测值)；Glycolytic Capacity=(寡霉素注射后最大的检测值)-(葡萄糖注射前最后一个检测值)，具体示意图参见Fig 4B。检测结束后，收集各孔细胞，利用细胞计数仪进行绝对计数，以每孔10 000细胞标准化OCR和EACAR的测量值。
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| Fig 3 Effects of Jar-AAT on mitochondrial respiration(x±s, n=3) A: EC109 cells were treated with Jar-AAT at indicated concentrations for 2 h and the dynamics of OCR were measured; B: Schematic diagram of indexes in overall OCR curve; C: The effects of Jar-AAT on the basal respiration; D: The effects of Jar-AAT on maximal respiration. E: Alteration of cellular ATP production in EC109 treated by Jar-AAT. OM, oligomycin; AA, antimycin; Rot, rotenone.**P < 0.01 vs control. |
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| Fig 4 Effect of Jar-AAT in regulating glycolysis of EC109 cells(x±s, n=3) A: EC109 cells were treated with Jar-AAT at indicated concentrations for 2 h and the dynamics of ECAR were measured; B: Schematic diagram of indexes in overall ECAR curve; C: Basal glycolytic rate of control and Jar-AAT pre-treated cells; D: Cellular glycolytic capacity in EC109 cells with or without Jar-AAT treatment. Glu: glucose; OM: oligomycin; 2-DG: 2-deoxy-D-glucose.*P < 0.05, **P < 0.01 vs control |
通过检测2-NBDG荧光强度，评价Jar-TTA对食管癌细胞葡萄糖摄取的抑制作用。EC109细胞接种于6孔板，使用含10% FBS的常规培养基培养过夜，待细胞贴壁后，移除常规培养基，PBS漂洗1次后，使用含0.5% FBS及0、4、8 μmol·L-1 Jar-TTA的培养基孵育EC109细胞6 h。小心移除上述培养基，加入100 μmol·L-1 2-NBDG(使用含0.5% FBS培养基稀释所得)，继续培养30 min。胰酶消化，离心收集细胞，置于冰上，使用预冷的PBS洗涤细胞2次，以去除未被细胞摄取的2-NBDG，将收集的细胞悬浮在冷PBS中，通过流式细胞术(488 nm激发，FL1)定量分析各组平均荧光强度。
2.7 Western blot不同浓度的Jar-TTA处理EC109细胞24 h后，将细胞全部离心收集，使用RIPA裂解液裂解细胞，低温离心，吸取上清则为总蛋白，蛋白浓度由BCA法测定。取60~100 μg总蛋白上样，经SDS-PAGE电泳分离后，湿法电转蛋白至硝酸纤维素膜(NC)上，利用5%脱脂奶粉室温封闭2 h，然后一抗室温孵育2 h或4 ℃孵育过夜后，辣根过氧化酶标记的二抗室温下孵育2 h，ECL试剂进行化学发光。胶片于暗室曝光后，扫描并保存结果。
2.8 统计学分析数据以x±s表示，利用F检验检测组间差异；应用GraphPad 6.0作图。
3 结果 3.1 Jar-TTA抑制EC109及KYSE-150细胞的生存不同浓度的Jar-TTA处理食管癌细胞EC109及KYSE-150 48 h后，MTT实验结果显示，Jar-TTA明显抑制了2种食管癌细胞的生长，且具有浓度依赖性(Fig 1B)，IC50值分别为(2.61±0.32) μmol·L-1和(4.65±0.55) μmol·L-1。由于EC109对Jar-TTA相对较为敏感，下述实验皆以EC109为细胞模型做进一步研究。
3.2 Jar-TTA诱导EC109凋亡不同浓度Jar-TTA作用EC109细胞24 h后，流式细胞术检测发现，Jar-TTA可明显诱导细胞凋亡的发生(Fig 2A)。Jar-TTA(2、4、8 μmol·L-1)诱导EC109早期凋亡率分别为(27.9±6.1)%、(71.1±9.3)%和(65.0±9.5)%，与正常对照组(5.6±3.2)%相比差异有显著性(P < 0.01)；另外，晚期凋亡率分别为(6.9±2.5)%、(8.4±3.4)%和(29.8±4.5)%，与对照组晚期凋亡率(0.6±0.3)%相比，差异亦具有显著性(Fig 2B)。使用Jar-TTA在同样的处理条件下，可见细胞凋亡形态上的变化，染色质浓缩、碎裂，凋亡小体形成等典型凋亡状态(Fig 2C)，表明Jar-TTA具有诱导细胞凋亡作用。
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| Fig 2 EC109 cell apoptosis induced by Jar-TTA(x±s, n=3) A: Representative flow cytometry pictures of EC109 cells treated by Jar-TTA for 24 h; B: Data of early and late apoptosis(x±s, n=3).**P < 0.01 vs control; C: Hoechst 33258 fluorescent staining, apoptosis morphology was observed by fluorescence microscopy(×200). |
ECAR和OCR分别代表了细胞的糖酵解水平和氧化磷酸化活性[8]。如Fig 3A所示，4、8 μmol·L-1 Jar-TTA预处理EC109 2 h，明显抑制线粒体的氧化磷酸化功能，并且相对于正常细胞，Jar-TTA预处理细胞基础氧耗率、最大呼吸和ATP产生量均明显降低(P < 0.01，Fig 3C、3D)。另外，4、8 μmol·L-1 Jar-TTA预孵育EC109细胞2 h，亦可明显抑制细胞糖酵解过程(Fig 4A)；如Fig 4C、4D所示，相较于对细胞基础糖酵解水平的抑制，Jar-TTA更为强烈地抑制了EC109细胞的最大糖酵解能力，差异均具有显著性(P < 0.01)。上述结果表明，Jar-TTA具有细胞糖酵解及线粒体氧化磷酸化的双重抑制作用。
3.4 Jar-TTA降低EC109线粒体膜电位荧光探针JC-1在较高线粒体电位下呈现强的橙色荧光；在线粒体膜电位较低情况下，JC-1则呈现绿色荧光[7]。如Fig 5A所示，相对于正常细胞，4 μmol·L-1的Jar-TTA作用EC109细胞24 h后，橙色荧光相对减弱，并显示了一定量的绿色荧光，提示线粒体膜电位有所下降；8 μmol·L-1 Jar-TTA作用EC109细胞24 h后，橙色荧光几乎完全消失，线粒体呈现强的绿色荧光，证明此时线粒体膜电位已崩溃丧失。另外，流式细胞术定量分析发现，4、8 μmol·L-1的Jar-TTA作用下，低线粒体膜电位的细胞比例分别为32.9%和59.1%，与对照组5.0%相比，线粒体膜电位下降的细胞数明显增多(Fig 5B)。这些结果表明Jar-TTA可以致使线粒体膜电位下降，从而诱导细胞线粒体功能损伤，Jar-TTA抑制线粒体氧化磷酸化的作用可能与此有关。
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| Fig 5 Mitochondriotoxic effects of Jar-AAT in EC109 A: JC-1 fluorescent staining, the drop of MMP in EC109 treated with Jar-AAT at indicated concentrations for 24 h was observed by fluorescence microscopy(×200); B: Representative flow cytometry pictures of EC109 cells treated by 0, 4 and 8 μmol·L-1 Jar-TTA for 24 h and the percentages of cells with low MMP were given. |
如Fig 6A所示，与正常对照组相比，4、8 μmol·L-1 Jar-TTA作用细胞6 h，荧光强度明显左偏，表明Jar-TTA可抑制EC109葡萄糖摄取，且其作用与浓度有关。与空白对照组相比，4、8 μmol·L-1 Jar-TTA使EC109细胞的葡萄糖摄取能力分别下降约(45.4±12.8)%和(60.5±9.32)%(P < 0.01)，见Fig 6B。上述结果提示，Jar-TTA的糖酵解抑制作用和其阻止葡萄糖摄取有关。
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| Fig 6 Glucose uptake inhibited by Jar-AAT(x±s, n=3) A: Representative flow cytometry pictures of the 2-NBDG uptake in EC109 cells treated by Jar-TTA at indicated concentrations for 6 h; B: Alteration of mean 2-NBDG fluorescence in EC109.**P < 0.01 vs control. |
Fig 7的Western blot检测显示，与对照组相比，不同浓度的Jar-TTA作用EC109 24 h后，GLUT4及LDHA蛋白表达明显下调，且呈浓度依赖性。该结果表明，Jar-TTA通过下调GLUT4和LDHA蛋白，阻滞了EC109细胞的葡萄糖摄取水平以及抑制了糖酵解进程。
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| Fig 7 GLUT4 and LDHA levels in EC109 decreased by Jar-AAT(x±s, n=3) **P < 0.01 vs control |
哺乳动物细胞可通过线粒体OXPHOS和糖酵解两种糖代谢方式供应能量ATP。常氧情况下，正常细胞糖代谢主要由线粒体OXPHOS产生ATP以提供代谢活动所需要的能量，但与正常细胞不同，即使在有氧情况下，肿瘤细胞依旧异常活跃地摄取葡萄糖，进行有氧糖酵解(Warburg效应)[9]。长期以来，人们基于肿瘤细胞特有的Warburg效应不仅开发了系列抗肿瘤新化合物，也摸索了多套肿瘤化疗方案，但所得结果不尽相同，喜忧参半[10]。究其原因是因为肿瘤代谢呈异质性，不同肿瘤之间存在明显的代谢差异；即使同一肿瘤的不同细胞之间，也存在明显代谢差异。虽然Warburg效应在肿瘤细胞中表现明显，但线粒体的OXPHOS仍对肿瘤细胞生存起着重要的调节作用，甚至在某些肿瘤中，OXPHOS是主要的供能方式，该类肿瘤细胞则对有氧糖酵解抑制剂并不敏感[11-12]。
近几年，由多个科研团队将糖酵解抑制剂(如2-deoxy-D-glucose)和OXPHOS抑制剂(如线粒体靶向药物Mito-Q或小檗碱)联用，进行肿瘤化疗取得了满意的效果[13-14]。就单个药物同时抑制肿瘤细胞糖酵解和OXPHOS的研究也有报道，Marín-Hernández等[15]研究发现，5 μmol·L-1铜配位化合物(Casiopeina Ⅱ-gly)作用HeLa细胞24 h后，同时抑制了糖酵解(抑制率为40%)和OXPHOS(抑制率为80%)，展现了良好的抗肿瘤活性，并具有较好的肿瘤选择性。Zhao等[16]研究也发现，维生素E衍生物ESeroS-GS可通过下调HK2及具有电子传递功能的complex Ⅱ/Ⅲ/Ⅳ等的表达，以及降低线粒体膜电位(mitochondrial membrane potential，MMP)，同时抑制了乳腺癌细胞糖酵解和OXPHOS，从而抑制肿瘤细胞的增殖、迁移和侵袭，而对人正常乳腺上皮细胞不产生相应毒性。本研究也证实，Jar-TTA可通过双重抑制糖酵解和OXPHOS，诱导食管癌细胞凋亡。并且Jar-TTA抑制EC109基础呼吸、最大呼吸以及ATP的生成，可能与Jar-TTA降低MMP有关。除诱导MMP下降之外，Jar-TTA是否对线粒体中具有电子传递功能的complex Ⅱ/Ⅲ/Ⅳ也有调控作用则需要进一步研究。
此外，很多研究已经证实，葡萄糖转运体(glucose transporters，GLUTs)在肿瘤细胞中高表达，有效阻止其表达可以从源头阻断原料供应，从而可作为研发糖酵解抑制剂的切入点[17]。另外，在糖酵解过程中，乳酸脱氢酶A(lactic dehydrogenase A，LDHA)是催化丙酮酸和乳酸相互转化的同工酶，在癌细胞中亦高表达，这使得肿瘤细胞能够不受氧气限制，将大多数的葡萄糖转变为乳酸，加速细胞生长和增殖。目前通过抑制LDH-A活性来治疗肿瘤已成为最具吸引力的研究方向[18]。本研究证明，Jar-TTA可明显下调GLUT4和LDHA蛋白的表达，其很可能是Jar-TTA抑制EC109糖摄取、基础糖酵解水平及最大糖酵解能力的根本原因。
总之，Jar-TTA已然是一个具有糖酵解/OXPHOS双重抑制功能的新的抗肿瘤候选化合物。本文的系统研究有望为设计合成活性更高、毒性更低、作用机制更为独特的新型二萜衍生物提供实验依据和理论支持。
( 致谢: 本实验主要在阜外华中心血管病医院药学部药学研究实验室完成，在此感谢郑州大学药学院可钰教授给予的无私帮助，感谢郑州中谱仪器设备有限公司提供生物能量分析仪Seahorse XFp及相关技术支持。)
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