2. 新疆医科大学基础医学院免疫学教研室，新疆 乌鲁木齐 830011
2. Dept of Immunology, Basic Medical College, Xinjiang Medical University, Urumqi 830011, China
心肌纤维化是慢性心衰发展过程中的最重要的病理表现，但发病机制尚未完全揭示，主要认为肾素-血管紧张素系统(renin-angiotensin system，RAS)过度激活是导致心肌纤维化的因素。抗心肌纤维化的一线药物血管紧张素转化酶抑制剂(angiotensin coverting enzyme inhibitor，ACEI)或血管紧张素Ⅱ一型受体拮抗剂(angiotensinⅡ type1 receptor antagonist，AT1)长期应用出现“醛固酮逃逸”现象[1]。醛固酮将会促进转化生长因子β(transforming growth factor β，TGF-β)等的表达，进而刺激多种细胞向纤维母细胞转化，增加基质蛋白等的合成而促纤维化[2-3]。因此，阐明心肌纤维化发生、发展的机制，及预防和治疗是现代医学研究领域的热点。
有报道称[4]，多种免疫细胞参与炎症反应，而调节性T细胞(regulatory T lymphocytes，Tregs)构建了T细胞的抗炎体系。自然性Tregs来源于胸腺，诱导型则依赖局部炎症环境产生。CD4+T淋巴细胞活化后，TGF-β的促进下向Tregs细胞分化，且通过进一步自分泌TGF-β等因子而被活化增殖(正反馈)。Tregs主要分泌TGF-β和IL-10，有报道[5]，静脉回输Tregs主要通过IL-10介导而逆转心肌纤维化。但是，TGF-β又是重要的致纤维化因子，故Tregs细胞在心肌纤维化进程中扮演怎样的角色还需进一步证实。
Kv1.3通道作为调控T淋巴细胞增殖的靶点意义重大，其通过维持细胞静息膜电位，使T细胞处于能被活化的状态[8]，T细胞活化后，促进第二信使Ca2+内流，增加细胞因子TGF-β的转录。通过阻断Kv1.3通道能抑制促炎细胞因子的产生和体外增殖[6-7]。前期研究发现[8]，Tregs可通过分泌较多的TGF-β，促进心肌成纤维细胞(cardiac fibroblasts，CFs)的增殖，而依普利酮则可能通过阻断Kv1.3通道，抑制Tregs细胞活化增殖，减少TGF-β的分泌，而未引起CFs的增殖。基于此，本研究通过沉默Kv1.3通道基因并转染Tregs细胞，拟进一步明确Kv1.3通道在Tregs细胞活化增殖致心肌纤维化的靶点地位，明确依普利酮是否通过直接阻断Kv1.3通道功能，抑制Tregs细胞活化增殖而抑制纤维化进程。
1 材料与方法 1.1 实验动物SPF级SD大鼠，♂，体质量(200±20)g，由新疆维吾尔自治区实验动物研究中心提供，实验动物生产许可证号: SYXK(新)2016-0003。
1.2 药物与试剂Biotin小鼠抗兔CD4(BD554836)、PE小鼠抗大鼠CD25(BD554866)，购自美国BD公司；Multisort microbeads Kit、Anti-PE Microbeads，购自德国Miltenyi Biotic公司；依普利酮、大鼠淋巴分离液(LTS 1083)、胎牛血清，购自Sigma公司；RPMI 1640培养基，购自HyClone公司；SYBRTM Select Master Mix, 购自Life Technologies；抗大鼠CD3单抗、抗大鼠CD28单抗，购自Thermofisher eBioscience公司；重组大鼠IL-2、TGF-β1，购自Peprotech公司；IL-10、TGF-β试剂盒，购自武汉华美生物技术有限公司；靶向抑制Kv1.3的慢病毒载体及阴性对照病毒载体，由上海吉凯基因公司构建及包装。
1.3 仪器Midi型磁力架分选器、25LS型分选柱(德国Miltenyi)；KDC 40低速离心机(中科中佳科学仪器有限公司)；HF 240二氧化碳培养箱(Heal Force)；CT15RE型低温离心机(日本Hitachi)；Port-a-path®工作站、负压控制器、NPC®-1芯片(德国Nanion，Part-a-Patch®NPC®-1)；EPC-10放大器(德国HEKA)。
1.4 方法 1.4.1 大鼠Tregs细胞的分选及活化摘取正常大鼠脾脏，通过加入大鼠淋巴分离液，密度梯度离心得到单个核细胞；免疫磁珠双阳性分选两步法获得Tregs细胞(纯度≥95%)。将分离好的Tregs细胞接种于前1 d由CD3抗体包被过夜，并于次日吸出CD3抗体，用等体积的PBS体积洗板1次，含CD28抗体(2 mg·L-1)的24孔板中，在37 ℃、5% CO2饱和湿度下，用含IL-2(10 g·L-1)、TGF-β1(5 μg·L-1)、双抗100 kU·L-1及RPMI 1640培养基500 μL培养活化该细胞，细胞在刺激24 h后体积略微增大，进入活化状态，刺激48 h可进行病毒感染。
1.4.2 RNAi-Kv1.3通道基因转染大鼠Tregs细胞收集活化的Tregs细胞，以无血清培养基饥饿Tregs细胞12 h, 以备转染。按每孔1×105个细胞的浓度接种于24孔板中，按MOI=100，将LV-KCNA3(64803-1)、LV-KCNA3(64804-1)、LV-KCNA3(64805-1)3个不同的干扰靶点及阴性对照病毒CON077(No target Kv1.3)(Tab 1)，分别加入活化的Tregs细胞，同时加入感染增强液聚凝胺至终浓度6 μg ·L-1, 最终感染体积为500 μL，十字交叉法晃动24孔板以保证铺板均匀；于1 000 r·min-1离心感染60 min。离心结束后，将平板放入37 ℃、5% CO2培养箱中培养12 h, 于次日加入500 μL含IL-2 (10 μg·L-1)、TGF-β1(5 μg·L-1)、双抗100 kU·L-1及RPMI 1640培养基继续培养。倒置荧光显微镜观察细胞转染后荧光。
| Gene | Gene number | Sequence | |
| KCNA3 | NM_019270 | KCNA3-RNAi(64803-1) | GAGGAGATCCGCTTCTACCAA |
| KCNA3-RNAi(64804-1) | GAGCTGCTGGTGCGATTCTTT | ||
| KCNA3-RNAi(64805-1) | TTGCCGGTTCCTGTGATTGTT | ||
| Scrambled RNAi | - | CON077 | TTCTCCGAACGTGTCACGT |
将LV-KCNA3(64803-1)、LV-KCNA3(64804-1)、LV-KCNA3(64805-1)三个不同的干扰靶点及阴性对照病毒CON077(No target Kv1.3)，感染Tregs细胞成功后，TRIzol法提取总RNA, 逆转录cDNA, 于冰上将2.0 μL cDNA加入扩增体系(SYBR 5 μL、Prim 0.7 μL、H2O 1.6 μL)，共10 μL。反应条件为：61 ℃、5 min，42 ℃、1 h，70 ℃、5 min，4 ℃循环。PCR反应以GAPDH作为内参照(管家基因)，每个样本均以GAPDH的表达来标准化，所有孔均设3个复孔，实验重复3次，每次实验设标准曲线。以相对定量2-△△CT表示目的基因的表达相对于对照组的变化倍数，△△CT=实验组(目的基因的拷贝数-管家基因的拷贝数)/对照组(目的基因的拷贝数-管家基因的拷贝数)。同时比较干扰载体组及阴性对照病毒组基因的表达量，计算干扰效果。引物序列见Tab 2。
| Gene | Primer sequence(5’→3’) | Annealing temperature/℃ |
| GAPDH | Upstream:CCCATCTATGAGGGTTACGC | 62 |
| Downstream:TTTAATGTCACGCACGATTTC | ||
| Kv1.3 | Upstream:AGCTTCGACGCCATCCTCTACTAC | 61 |
| Downstream:TCCTCACGGAACTTCTCCATAGCC |
使用EPC10放大器，负压控制器通过数据转换器与计算机连接，刺激信号及电流、电压输人信号的采集均由软件控制。NPC®-1芯片内层注入5 μL电极内液，NPC®-1芯片电极入水阻抗为8~12 MΩ。膜电位钳制在-80 mV，Tregs细胞Kv1.3钾通道予以-80~+40 mV斜率刺激，刺激时长为500 ms。记录得到Kv1.3钾通道的电流-电压(Ⅰ-Ⅴ)曲线。
1.4.5 细胞因子水平检测将细胞分为Tregs组、Tregs+EPL组、RNAi-Tregs组、RNAi-Tregs+EPL组，收集各组细胞培养液，外液通过1 300 r·min-1离心10 min, 收集上清液，分装置于200 μL EP管(避免反复冻融)；内液细胞分泌因子通过PBS清洗，放在-20 ℃冰箱10 min，37 ℃水浴锅中5 min，如此反复冻融3~5次，离心收集上清液。按照试剂盒说明书检测各组细胞内外液分泌的IL-10、TGF-β水平。
1.4.6 统计学处理采用SPSS 17.0进行统计学分析，数据采用x±s表示，分析数据及作图采用Graph Prism 5.0软件绘制，组间比较采用方差分析。
2 结果 2.1 Treg细胞的分选免疫磁珠分选的Tregs细胞经过CD3/CD28刺激活化，细胞体积变大，边缘透亮(Fig 1)。
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| Fig 1 Tregs and CFs cell separation A: Immunomagnetic beads separation Tregs cell (×200); B: Stimulate the activation of Tregs by CD3/CD28 (×100); C: Stimulate the activation of Tregs by CD3/CD28 (×200); D: Lentivirus infects Tregs cell(×200). |
Tregs细胞在MOI=100、感染增强液聚凝胺6 μg L-1、离心转染条件下，进行GFP慢病毒转染后，在荧光倒置显微镜下可观察到GFP绿色荧光蛋白(Fig 2)。
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| Fig 2 Tregs cells infected by lentivirus |
LV-Kcna3 64803-1(Kv1.3-64803)、LV-Kcna3 64804-1(Kv1.3-64804)、LV-Kcna3 64805-1(Kv1.3-64805)三个不同的干扰靶点及阴性对照病毒CON077(No target Kv1.3)感染Tregs细胞成功后，Kv1.3-64803转染Tregs细胞Kv1.3 mRNA表达较其他各组表达明显较低(P < 0.01)，其中干扰靶点Kv1.3-64803对Tregs细胞mRNA抑制率最大为78%(Fig 3)。
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| Fig 3 Relative expression and inhibition rate of Kv1.3 channel mRNA in each group(x±s, n=9) A:Control; B:NO-target kv1.3;C:KV1.3-64803;D:KV1.3-64804;E:KV1.3-64805.*P < 0.05, **P < 0.01 vs control; ##P < 0.01 vs Kv1.3-64804 or Kv1.3-64805 |
全细胞膜片钳模式测定正常Tregs细胞与沉默组Tregs细胞在+40 mV Kv1.3钾通道电流变化，与正常组Tregs细胞Kv1.3钾通道+40 mV的电流峰值密度[(601.7±11.76) pA/pF，n=10]相比，沉默组峰值电流密度[(172.5± 16.94) pA/pF，n=12]，抑制率为71.3%(Fig 4)。
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| Fig 4 Kv1.3 channel current changes between normal group and silent group A: The original graph of the current density with the slope stimulation, the dotted line is the standard error; B: The Kv1.3 current density bar chart under +40 mv. **P < 0.01 vs control. |
ELSIA法检测细胞Tregs组、Tregs+EPL组、RNAi-Tregs组、RNAi-Tregs+EPL组IL-10、TGF-β分泌水平，EPL浓度为30 μmol·L-1。与Tregs组相比，RNAi-Tregs组内外液TGF-β水平明显降低(P < 0.01)，Tregs+EPL组内外液TGF-β水平亦降低(P < 0.05)；与RNAi-Tregs组相比，RNAi-Tregs+EPL组内外液TGF-β水平无明显变化；而Tregs组、Tregs+EPL组、RNAi-Tregs组和RNAi-Tregs+EPL组内外液IL-10水平无明显变化(Tab 3)。
| Group | IL-10 | TGF-β | |||
| Intracellular | Extracellular | Intracellular | Extracellular | ||
| Tregs | 28.48±2.79 | 38.37±4.88 | 174.18±4.15 | 154.96±1.29 | |
| Tregs+EPL | 26.53±4.60 | 27.01±3.90* | 139.54±3.90** | 124.05±0.56* | |
| RNAi-Tregs | 26.58±1.86 | 33.96±2.88 | 123.49±1.91** | 111.59±4.27** | |
| RNAi-Tregs+EPL | 21.47±1.51 | 32.79±1.92 | 120.56±2.47 | 110.66±0.91 | |
| *P < 0.05, **P < 0.01 vs Tregs | |||||
Tregs在机体免疫与平衡中占据着重要地位。但是，Tregs在炎症情况下对器官纤维化的作用并未引起足够重视，而且有争议：一种假设认为免疫抑制Tregs能引起器官纤维化；另一种观点却认为，Tregs主要分泌TGF-β而导致了纤维化。因此，减少不必要的T淋巴细胞活化或增强Tregs细胞调节作用，有可能作为治疗心力衰竭的新靶标[9-10]。
越来越多的间接和直接证据提示，Kv1.3通道与Tregs细胞的关系密切。Varga等[11]在多发性硬化患者的Tregs中发现Kv1.3通道含量较少。Estes等[12]利用高通量定量方法，分析了人初始淋巴细胞的K+通道功能性活动，结果提示Kv1.3通道的活性可作为T细胞的功能活性标志物。而既往的研究[13-15]发现，可以通过沉默记忆T细胞上的Kv1.3通道，作为治疗自身性免疫性疾病的一种手段。因此，RNAi技术在细胞与分子水平上很大程度上都得到了广泛应用。本研究通过采用RNAi技术，将RNAi-Kv1.3慢病毒载体转染至大鼠Tregs细胞。Tregs细胞主要为悬浮细胞，非贴壁生长，难转染。经慢病毒转染后，沉默组Kv1.3通道基因水平抑制率达到78.0%，电流降低71.3%。ELSIA法检测Tregs细胞分泌因子水平，Tregs+EPL组内外液TGF-β水平降低，RNAi-Tregs组内外液TGF-β水平也明显降低，但是RNAi-Tregs+EPL组内外液TGF-β水平相比RNAi-Tregs组却无明显变化。而体外不给予EPL或给予EPL情况下，RNAi-Kv1.3 Tregs组并没有任何变化，这表明沉默Kv1.3通道后，EPL不再发挥抑制Tregs细胞分泌TGF-β水平；且沉默Kv1.3通道后，可抑制Tregs细胞内外液分泌的TGF-β水平，与EPL可通过下调Tregs细胞Kv1.3通道表达，进而抑制Tregs细胞内外液分泌的TGF-β水平结果相一致。这表明Kv1.3通道在Tregs细胞调控纤维化的作用中扮演着重要角色。
以上研究结果阐明了Kv1.3通道介导着Tregs细胞的活化增殖，而EPL可通过直接抑制Kv1.3通道，进而减少TGF-β的分泌，从而抑制心肌纤维化，这与我们前期分子对接显示结果相一致[16]。提示Kv1.3通道可作为心衰诊治的潜在免疫学靶点。
| [1] |
Teriet L, Vanesch J H, Roks A J, et al. Hypertension renin-angiotensin-aldosterone system alterations[J]. Circ Res, 2015, 116(6): 960-75. doi:10.1161/CIRCRESAHA.116.303587 |
| [2] |
Buonafine M, Martinez martinez E, Amador C, et al. Neutrophil gelatinase-associated lipocalin from immune cells is mandatory for aldosterone-induced cardiac remodeling and inflammation[J]. J Mol Cell Cardiol, 2018, 115: 32-8. doi:10.1016/j.yjmcc.2017.12.011 |
| [3] |
Harvey A P, Montezano A C, Hood K Y, et al. Vascular dysfunction and fibrosis in stroke-prone spontaneously hypertensive rats: the aldosterone-mineralocorticoid receptor-Nox1 axis[J]. Life Sci, 2017, 179: 110-9. doi:10.1016/j.lfs.2017.05.002 |
| [4] |
魏伟. 炎症免疫反应软调节[J]. 中国药理学通报, 2016, 32(3): 297-303. Wei W. Soft regulation of inflammatory immune response[J]. Chin Pharmacol Bull, 2016, 32(3): 297-303. doi:10.3969/j.issn.1001-1978.2016.03.001 |
| [5] |
Wei L. Immunological aspect of cardiac remodeling:T lymphocyte subsets in inflammation mediated cardiac fibrosis[J]. Exp Mol Pathol, 2011, 90(1): 74-8. doi:10.1016/j.yexmp.2010.10.004 |
| [6] |
Susumu O. Physiological role of K+ channels in the regulation of T cell function[J]. Yakugaku Zasshi, 2016, 136(3): 479-83. doi:10.1248/yakushi.15-00246-4 |
| [7] |
Kazama I, Tamada T, Tachi M, et al. Usefulness of targeting lymphocyte Kv1.3 channels in the treatment of respiratory diseases[J]. In amm Res, 2015, 64(10): 753-65. |
| [8] |
邵培培, 徐琦, 李少华, 等. 依普利酮基于阻断Kv1.3通道对抗Treg细胞体外促成纤维细胞增殖作用[J]. 中国药理学通报, 2017, 33(11): 1-6. Shao P P, Xu Q, Li S H, et al. Antagonization of eplerenone on proliferation of cardiac fibroblasts induced by cocultured Treg cells based on inhibition of Kv1.3 channel of Tregs[J]. Chin Pharmacol Bull, 2017, 33(11): 1-6. |
| [9] |
Chen Z, Yan W, Mao Y, et al. Effect of aerobic exercise on Treg and Th17 of rats with ischemic cardiomyopathy[J]. J Cardiovasc Transl Res, 2018, 11(3): 230-5. doi:10.1007/s12265-018-9794-0 |
| [10] |
Han J Y, Cho S S, Yang J H, et al. The chalcone compound isosalipurposide (ISPP) exerts a cytoprotective effect against oxidative injury via Nrf2 activation[J]. Toxicol Appl Pharmacol, 2015, 287(1): 77-85. doi:10.1016/j.taap.2015.05.015 |
| [11] |
Varga Z, Csepany T, Papp F, et al. Potassium channel expression in human CD4+ regulatory and naive T cells from healthy subjects and multiple sclerosis patients[J]. Immunol Lett, 2009, 124(2): 95-101. doi:10.1016/j.imlet.2009.04.008 |
| [12] |
Estes D J, Memarsadeghi S, Lundy S K, et al. High-throughput profiling of ion channel activity in primary human lymphocytes[J]. Anal Chem, 2008, 80(10): 3728-35. doi:10.1021/ac800164v |
| [13] |
Ramisheui S, Kedmi R, Gold smith M, et al. Systemic gene silencing in primary T lymphocytes using targeted lipid nanoparticles[J]. ACS Nano, 2015, 9(7): 6706-16. doi:10.1021/acsnano.5b02796 |
| [14] |
Chimote A A, Hajdu P, Kottyan L C, et al. Nanovesicle-targeted Kv1.3 knockdown in memory T cells suppresses CD40L expression and memory phenotype[J]. J Autoimmun, 2016, 69: 86-93. doi:10.1016/j.jaut.2016.03.004 |
| [15] |
Grishkan I V, Tosi D M, Bowman M D, et al. Antigenic stimulation of Kv1.3-deficient Th cells gives rise to a population of Foxp3-independent T cells with suppressive properties[J]. J Immunol, 2015, 195(4): 1399-1407. doi:10.4049/jimmunol.1403024 |
| [16] |
Shao P P, Liu C J, Xu Q, et al. Eplerenone reverses cardiac fibrosis via the suppression of Tregs by inhibition of Kv1.3 channel[J]. Front Physiol, 2018, 9: 899. doi:10.3389/fphys.2018.00899 |