2. 贵阳妇幼保健院围产期保健科,贵州 贵阳 550004;
3. 贵州医科大学地方病与少数民族疾病教育部重点实验室,贵州 贵阳 550004
2. Perinatal Health Care Section, Guiyang Maternal and Child Health Hospital, Guiyang 550004, China;
3. Key Lab of Endemic Diseases and Minority Diseases, Ministry of Education, Guiyang 550004, China
甲基苯丙胺(methamphetamine,METH)属于苯丙胺类神经兴奋剂(amphetamine-typed stimulant,ATS),俗称“冰毒”,它具有药物依赖、中枢神经兴奋性、致幻、食欲抑制和拟交感效应等药理、毒理学特性[1]。目前,METH的神经毒性作用的损伤学说主要有以下几种:神经元凋亡、炎症反应、氧化应激、线粒体功能紊乱等[2-4]。其中,线粒体功能及凋亡通路与METH的致病机制越来越受到学者关注。有研究认为,线粒体分裂过度或融合不足都会导致线粒体碎裂,降低呼吸作用和能量生产,增加神经元损伤和细胞凋亡的可能性[5]。线粒体分裂蛋白1(Fission 1,Fis1)的过度表达可以导致线粒体分裂,造成线粒体功能障碍,导致细胞凋亡,药物抑制分裂可以减轻细胞凋亡[6]。在METH研究中,蒋雷等[7]发现,METH处理后,短时间内神经细胞线粒体膜电位(mitochondrial membrane potential, MMP)下降,膜通透性转运孔道异常开放,Bax水平上调,继而激活caspase-3凋亡蛋白,导致神经元损伤。目前,有越来越多的研究者关注METH致神经细胞毒性与线粒体功能紊乱之间的关系,但相关机制还未阐明。本实验拟通过METH作用于体外培养的人神经母细胞瘤细胞株(human neuroblastoma cells,SH-SY5Y cells),观察MMP水平、线粒体超微结构及线粒体融合蛋白1(mitofusion 1,Mfn1)和Fis1蛋白表达水平,探索线粒体在METH致体外培养SH-SY5Y细胞损伤中的作用。
1 材料与方法 1.1 细胞株人神经母细胞瘤细胞株SH-SY5Y,购自美国Sigma公司。
1.2 试剂与仪器METH(美国Cerilliant公司,标准品编号:M-009,纯度:99.9%);胎牛血清(FBS,美国BI公司);CCK-8细胞增殖-毒性检测试剂盒(东仁化学科技有限公司);JC-1线粒体膜电位检测试剂盒(上海碧云天公司);兔抗人Mfn1单克隆抗体、兔抗人Fis1单克隆抗体(美国Abmart公司);兔抗人β-actin抗体(美国Gene Tex公司)。恒温细胞培养箱(美国Thermo公司);ELX800UV酶标仪、化学发光成像系统(美国Bio-Rad公司);DMi8型倒置显微镜(德国Leica公司);H-7650型透射电镜(日本Hitachi公司)。
1.3 CCK-8法检测细胞增殖将体外培养的SH-SY5Y细胞制成细胞悬液,按1×104/孔的密度接种于96孔板中,置37 ℃、5% CO2培养箱中培养,待细胞贴壁长至60%~70%时,换含有METH(0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5 mmol·L-1)的培养液培养,时间为3、6、12、24 h,每组3个复孔。向每孔加入10 μL CCK-8溶液,将培养板在培养箱中孵育3 h后,用酶标仪测定450 nm处的吸光度(OD)值,并计算细胞存活率。细胞存活率=(实验组OD值-空白组OD值)/(对照组OD值-空白组OD值)×100%,取细胞存活率较高的METH处理组进行实验。采用成组设计,在含SH-SY5Y细胞的培养液中加入不同浓度的METH(0.0、1.0、1.5、2.0 mmol·L-1),浓度的选择参照文献[8]以及CCK-8实验结果,培养时间分别为3、6、12、24 h。
1.4 JC-1法检测MMP按照试剂盒说明书操作。使用倒置荧光显微镜观察METH处理SH-SY5Y细胞3、6、12、24 h后的各组细胞的红、绿荧光,计算机采集荧光图像,使用Image J软件重叠红绿荧光,将合成荧光的光密度比值作为膜电位表达水平值。
1.5 透射电镜观察SH-SY5Y细胞线粒体超微结构收集细胞;将细胞固定于2.5%戊二醛溶液中4 h(4 ℃),0.1 mol·L-1 PBS漂洗;1%锇酸溶液后固定2 h(4 ℃),0.1 mol·L-1 PBS漂洗;丙酮脱水;Epon812树脂包埋;切片;醋酸铀、硝酸铅染色;上机观察。
1.6 Western blot法检测Mfn1和Fis1蛋白表达水平收集METH处理SH-SY5Y细胞3、6、12、24 h后的各组样本,使用RIPA裂解细胞提取总蛋白,超微量紫外分光光度计检测各样本蛋白浓度。经12%聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白、转膜、室温封闭2 h后,使用Mfn1(1 :1 500)、Fis1(1 :2 000)、β-actin(1 :5 000)一抗4 ℃孵育过夜,二抗(1 :10 000)室温孵育1 h。将PVDF膜与超敏发光液(ECL)试剂反应1 min后,使用化学发光成像系统扫描PVDF膜,Image J软件分析Mfn1和Fis1蛋白条带,使用β-actin蛋白条带校正。
1.7 统计学处理运用SPSS 24.0统计软件分析数据,计量资料数据用x±s表示,采用单因素方差分析,方差齐时进一步两两比较采用LSD-t分析,方差不齐时组间两两比较采用Dunnett′s T3检验。
2 结果 2.1 CCK-8法检测结果如Fig 1所示,使用不同浓度的METH处理SH-SY5Y细胞3、6、12、24 h后,METH抑制SH-SY5Y细胞增殖,SH-SY5Y细胞存活率随METH浓度和作用时间的增加而减小。由于METH浓度>2.0 mmol·L-1时,对应的SH-SY5Y细胞存活率较小,故选取1.0、1.5、2.0 mmol·L-1 METH处理组作为实验对象。
2.2 SH-SY5Y细胞MMP水平Tab 1结果显示,与对照组比较,各METH处理组MMP红、绿荧光比值呈明显降低趋势。在荧光显微镜下,红色荧光除个别细胞较强外,随METH浓度升高主要呈下降趋势;绿色荧光强度随METH浓度升高主要呈上升趋势(Fig 2)。
METH/mmol·L-1 | Time/h | |||
3 | 6 | 12 | 24 | |
0(Control) | 0.89±0.01 | 0.95±0.04 | 0.90±0.01 | 1.03±0.06 |
1.0 | 0.82±0.02* | 0.76±0.02* | 0.71±0.03* | 0.69±0.02* |
1.5 | 0.67±0.01* | 0.66±0.01* | 0.61±0.03* | 0.59±0.02* |
2.0 | 0.55±0.02* | 0.52±0.01* | 0.48±0.04* | 0.39±0.02* |
*P < 0.05 vs control |
如Fig 3所示,透射电镜下观察对照组SH-SY5Y细胞线粒体呈椭圆形棒状双层膜结构,线粒体嵴正常、清晰;低METH组(1.0 mmol·L-1)SH-SY5Y细胞线粒体膜结构尚完整,部分嵴出现肿胀及断裂;高METH组(2.0 mmol·L-1)SH-SY5Y细胞线粒体内外膜可见破损,线粒体嵴扭曲变形且大量减少或消失,部分空泡化;低、高METH组SH-SY5Y细胞线粒体椭圆形棒状结构减少,小球状结构随之增加。此外,高METH组发现典型的线粒体自噬过程(Fig 4)。
2.4 METH对Mfn1蛋白表达的影响如Fig 5所示,与对照组比较,METH作用SH-SY5Y细胞3、12、24 h时,Mfn1蛋白表达均降低(P < 0.05);与对照组比较,METH作用SH-SY5Y细胞6 h时,METH(1.5、2.0 mmol·L-1)处理组Mfn1蛋白表达水平均降低(P < 0.05)。相同时间内,随着METH浓度的升高,Mfn1蛋白表达水平呈降低趋势;与相同浓度的METH处理3 h比较,处理12 h时Mfn1蛋白表达呈下降趋势。
2.5 METH对Fis1蛋白表达的影响如Fig 6所示,与对照组比较,METH作用SH-SY5Y细胞3、24 h时,Fis1蛋白表达均升高(P < 0.05);与对照组比较,METH作用SH-SY5Y细胞6、12 h时,METH(1.5、2.0 mmol·L-1)处理组Fis1蛋白表达水平升高(P < 0.05)。相同时间内,随着METH浓度的升高,Fis1蛋白表达水平呈升高趋势;与相同浓度的METH处理3 h比较,处理24 h时Fis1蛋白表达呈上升趋势。
3 讨论METH具有极强的精神兴奋和致幻作用,长期滥用者甚至会出现精神障碍,METH的致病机制急待探明。研究认为,METH的离子化学特性可改变电子传递链(electron transport chain,ETC)电化学梯度,可影响ATP酶的活性和线粒体膜的完整性[9]。但线粒体形态及功能在METH致神经细胞损伤中的作用仍未阐明。本研究拟通过METH处理SH-SY5Y细胞,观察线粒体融合与分裂功能及其相应的形态学改变,观察线粒体在其发病机制中的作用。
实验发现,体外培养的SH-SY5Y细胞经METH处理后,MMP降低,且与METH的浓度和作用时间有依赖性。而MMP下降是细胞凋亡的一个早期标志[10],可能是我们实验中METH致SH-SY5Y细胞凋亡的早期信号。我们推测,当线粒体受到METH作用时,线粒体通透性转换孔(mitochondrial permeability transition pore,MPTP)持续开放,允许小分子通过,使膜两侧的离子梯度改变,导致线粒体膜电位下降[11-12],并且允许线粒体内的细胞色素C释放至细胞质,启动细胞凋亡[13]。
同时研究认为,MMP改变会引起细胞线粒体形态改变。其形态调节受线粒体动态调节蛋白控制,分别为线粒体融合蛋白和分裂蛋白,其中Mfn1和Fis1是主要蛋白,此过程称为线粒体动态平衡调节[14-15],是保证膜结构完整的重要条件,也是维持正常膜电位,防止细胞凋亡的重要机制。我们观察发现,对照组线粒体超微结构正常;而METH处理组细胞线粒体呈小球状结构,线粒体内外膜破损、嵴破坏,出现吞噬清除损伤的线粒体现象。Twig等[16]认为,线粒体分裂产生两个不均匀的小体,健康膜部分有较高的膜电位,可再融合;受损膜部分膜电位较低,易被自噬体吞噬。本实验METH处理细胞表现与Twig等的研究结果基本一致。我们认为METH处理后,细胞内的MMP下降,启动线粒体分裂,将膜电位较低部分分裂清除,启动自噬。为进一步证明我们的推测,我们同时检测了Mfn1和Fis1蛋白表达水平,发现在SH-SY5Y细胞中,Mfn1蛋白表达量下降,Fis1蛋白表达量上升, 且与METH处理时间和浓度相关,表明Mfn1和Fis1蛋白表达调节趋势与METH致细胞MMP下降及分裂现象相一致。这再次证实前面的推测。
综上所述,过量METH可能通过影响线粒体膜转运蛋白或线粒体膜,致体外培养的SH-SY5Y细胞MMP下降,线粒体趋向分裂,启动自噬和细胞凋亡;线粒体功能紊乱是METH致神经毒性的重要机制之一。
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