2. 武警湖北总队医院神经外科，湖北 武汉 430061;
3. 湖北科技学院基础医学院，湖北 咸宁 437100
2. Dept of Neurosurgery, Hospital of Hubei Province Armed Police Corps, Wuhan 430061, China;
3. College of Basic Medicine, Hubei University of Science and Technology, Xianning Hubei 437100, China
学习能力障碍(learning disability，LD)常出现在儿童期，又称儿童学习困难，最近美国《精神障碍诊断与统计手册(第五版)》将其定义为神经发育障碍，是世界各国普遍存在并引起广泛关注的儿童疾病之一。有研究指出[1]，约3%的神经发育障碍是由环境污染物暴露直接引起，另有25%是由广泛界定的环境因素与遗传易感性之间的相互作用导致。邻苯二甲酸二丁酯(dibutyl phthalate，DBP)作为一类典型的具有神经毒性的持久性有机污染物，可通过日常饮食、吸入和皮肤接触等途径影响儿童的学习、记忆能力[2-3]。Cho等[2]的流行病学研究提示，DBP暴露可明显降低小学生的学习成绩和智商。一些研究证实，孕期DBP暴露可持续诱发儿童的LD[3]。Wojtowicz等[4]研究揭示，DBP暴露所致儿童LD的关键在于：DBP可通过孕妇胎盘和婴幼儿血脑屏障，导致脑海马神经元凋亡，但其机制有待进一步阐明。
细胞外调节蛋白激酶(extracellular regulated protein kinases，ERK)主要包括ERK1和ERK2，与细胞凋亡、细胞增殖等重要生理过程存在联系[5]，ERK1/2通路活化可能参与DBP诱导的海马神经元凋亡。有资料显示[6]，ERK1/2通路活化涉及的内源性细胞凋亡与线粒体通透性增加(胞内Ca2+增加)、细胞色素C(cytochrome C，Cyt C)释放、caspase-3的激活密切相关。尼莫地平(nimodipine，Nim)作为第2代二氢吡啶类Ca2+拮抗剂，在脑相关疾病治疗中具有较大的临床应用价值。近年资料表明[7]，Nim对神经元有直接作用，具有神经和精神药理活性，可保护和促进记忆、智力恢复，但目前尚未见报道Nim对DBP所致学习记忆障碍的作用。本实验拟探究Nim对DBP所致KM小鼠学习记忆障碍的拮抗作用及其可能机制。
1 材料与方法 1.1 试剂与仪器DBP(纯度≥99.6%，货号84742)、Nim (纯度≥98%，货号N149)、Hoechst 33258荧光染料，均购自美国Sigma-Aldrich；TUNEL细胞凋亡原位试剂盒(南京凯基生物技术公司)；钙调蛋白(calmodulin，CaM)、钙/钙调素依赖性蛋白激酶Ⅱ(calcium/calmodulin dependent protein kinase Ⅱ，CaMKII)、蛋白激酶C(protein kinase C，PKC)、Cyt C、caspase-3酶联免疫试剂盒，均购自美国eBioscience；β-actin抗体(Abcam公司，货号ab37168)；ERK(货号4695)、p-ERK(货号4370)抗体，均购自国CST。EthoVision XT Version 12.0实验动物神经行为记录仪(荷兰Noldus)；蛋白电泳及转膜系统(美国Bio-Rad)；凝胶成像及分析系统(英国Syngene)；RM2245切片机(德国LEICA)；BX53显微镜(日本Olympus)；ELx800酶标仪(美国Bio-Tek)。
1.2 实验动物SPF级♂KM小鼠，体质量(18±1)g，购自湖北省实验动物研究中心，许可证号：SYXK(鄂)2015-0052。所有小鼠均饲养于SPF级标准动物房内，提供自由饮食，房间温度保持在(20~25) ℃，湿度为50%~70%，光照/黑暗周期为12 h。
1.3 实验分组与处理36只KM小鼠随机分成4组：对照组、50 mg·kg-1 DBP组、2 mg·kg-1 Nim组、50 mg·kg-1 DBP+2 mg·kg-1 Nim组(DBP+Nim)。DBP先用Tween 80助溶，再用生理盐水稀释至终浓度，DBP剂量及灌胃给药途径参考Yan等报道[8]，Nim剂量及腹腔给药途径参考Karande等报道[9]。给药处理如下：实验期间每天上午固定时间给药，DBP组小鼠每天灌胃50 mg·kg-1 DBP 1次，给药体积为10 mL·kg-1，连续给药28 d；DBP+Nim组小鼠每天腹腔注射2 mg·kg-1 Nim 1次，30 min后再灌胃给予50 mg·kg-1 DBP，连续给药28 d。
1.4 指标与方法 1.4.1 Morris水迷宫(morris water maze, MWM)实验MWM实验选用直径为100 cm圆桶形水箱，水深20 cm，水温控制范围(23±1)℃，逃逸平台位于SW象限的正中央，距离水面0.5 cm。小鼠的游泳轨迹等数据由水池正上方的摄像机记录，影像数据记录传入计算机，通过EthoVision软件分析。小鼠于给药d 22~26进行水迷宫定向航行训练，d 27为遗忘期，d 28撤掉平台后，进行空间探索实验，检测小鼠寻找目标平台的时间，记为逃逸潜伏期(s)。
1.4.2 脑海马CA1区切片病理学观察实验取材的脑海马组织用4%多聚甲醛固定，常规脱水，石腊包埋切片，进行苏木精-伊红(HE)染色和Nissl染色，显微镜下观察脑海马组织CA1的病理变化，拍片(×400倍)。
1.4.3 脑海马CA1区Hoechst 33258荧光染色脑海马组织CA1区切片经工作浓度为5 mg·L-1 Hoechst 33258荧光染液，染色5 min，用PBS水洗两遍后，置于荧光显微镜下观察，拍片(×200倍)。
1.4.4 脑海马CA1区TUNEL染色脑海马组织CA1区切片用二甲苯浸洗2次，每次5 min，脱蜡后用梯度乙醇(100%、95%、90%、80%、70%)至水，经蛋白酶K工作液(20 mg·L-1)在室温下处理15 min，PBS漂洗2次；加50 μL TUNEL反应混合液(阴性对照组仅加50 μL荧光素标记的dUTP液)于标本上，暗湿盒中37 ℃孵育60 min。PBS漂洗后，加100 μL DAB混合液(50 μL DAB+50 μL DAB底物缓冲液+50 μL H2O2+950 μL三蒸水)10 min显色，荧光显微镜下观察，拍片(×200倍)。
1.4.5 Western blot检测脑海马ERK、p-ERK蛋白表达脑海马用预冷的PBS缓冲液漂洗2~3次，去除血污，剪成小块置于匀浆器中。加入10倍于组织体积的蛋白提取试剂，冰浴彻底匀浆。将匀浆液转移至离心管中，振荡。冰浴30 min，期间用移液器反复吹打，确保匀浆液完全裂解。4 ℃、12 000 r·min-1离心5 min，收集上清，即为总蛋白溶液，测定样品蛋白浓度。10% SDS-PAGE电泳分离蛋白，转至PVDF膜上，加一抗封闭缓冲液室温封闭1 h，再分别加入一抗4 ℃过夜。用TBST洗膜3次，每次5 min，再加入二抗，室温孵育30 min，ECL显影。胶片扫描后，用AlphaEaseFC软件分析目标带的光密度值。
1.4.6 脑海马CaM、CaMKII、PKC、Cyt C及caspase-3水平的检测小鼠经称重后，取脑海马组织置于预冷PBS(pH 7.4)中漂洗，滤纸拭干，称重后置于匀浆器中，加预冷的PBS制成10%匀浆液，4 ℃、10 000×g离心10 min后取上清，待检。取脑海马组织匀浆上清液，按照ELISA试剂盒说明，测定CaM、CaMKII、PKC、Cyt C及caspase-3水平。
1.5 统计学分析实验数据均用x±s表示，采用GraphPad Prism 5.0软件进行统计分析，组间差异采用单因素方差分析(one-way ANOVA)结合Tukey检验比较。
2 结果 2.1 Nim改善DBP对小鼠学习记忆的影响与对照组比较，50 mg·kg-1 DBP组小鼠的潜伏期明显上升(P < 0.05)；与50 mg·kg-1 DBP组比较，DBP+Nim组小鼠的潜伏期有一定程度下降。小鼠60 s内寻找逃逸平台的游泳轨迹热点见Fig 1，DBP组小鼠的轨迹较少出现在目标象限，游泳路径没有目的性，且无规律；而DBP+Nim组小鼠在目标象限的轨迹有所增加。
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| Fig 1 Heatmap and latency of Morris water maze test of mice in different treatment groups A: Control group; B: 50 mg·kg-1 DBP group; C: 2 mg·kg-1 Nim group; D: DBP+Nim group; E: Latency of Morris water maze test. |
各组小鼠脑海马组织的CaM、CaMKII及PKC水平可反映胞内Ca2+水平。Tab 1结果显示，与对照组比较，DBP组小鼠脑海马CaM、CaMKII水平下降，PKC水平上升，差异均有统计学意义(P < 0.01)。与DBP组比较，DBP+Nim组小鼠脑海马组织中CaM、CaMKII水平明显上升(P < 0.01，P < 0.05)，PKC水平明显下降(P < 0.05)。
| Group | CaM/mg·L-1 | CaMKII/μg·L-1 | PKC/ng·L-1 |
| Control | 58.94±2.43 | 35.67±0.96 | 1190.00±206.04 |
| DBP(50 mg·kg-1) | 39.13±2.13** | 23.98±1.01** | 2028.33±184.78** |
| Nim(2 mg·kg-1) | 55.16±0.66 | 34.62±1.54 | 1230.83±165.50 |
| DBP+Nim | 51.77±1.83# | 29.92±1.36# | 1337.00±102.09# |
| **P < 0.01 vs control; #P < 0.05 vs DBP | |||
ERK未活化时分布在细胞质内，活化形式磷酸化ERK1/2 (p-ERK1/2)转位到核内，p-ERK1/2是ERK通路活化的主要标志。如Fig 2所示，各组小鼠脑海马ERK表达未见明显变化；与对照组比较，DBP组小鼠脑海马p-ERK表达水平明显上调(P < 0.01)；与DBP组比较，DBP+Nim组小鼠脑海马p-ERK1/2表达量下降(P < 0.05)。
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| Fig 2 ERK and p-ERK1/2 expression levels in hippocampus of KM mice in different treatment groups by Western blot (x±s, n=3) *P < 0.05, **P < 0.01 vs control; #P < 0.05 vs DBP |
脑系数的结果见Tab 2，与对照组比较，DBP组小鼠脑系数明显降低(P < 0.05)，经Nim处理后，DBP+Nim组小鼠脑系数有一定程度增加。Fig 3的HE染色结果显示，对照组小鼠脑海马CA1区的锥体神经细胞形态保持完好，呈多角形且排列整齐，边缘清晰；DBP组小鼠脑海马出现了损伤特征，锥体细胞肿胀变形，顶状树突变短或消失；经Nim处理后，DBP+Nim组小鼠脑海马锥体细胞虽仍表现出一定程度的损伤，但组织病理学的改变如肿胀变形、顶状树突变短或消失等损伤细胞的数量明显减少。Nissl染色结果显示，与对照组比较，DBP组小鼠脑海马神经细胞内Nissl小体大量缺失，细胞结构受到一定程度的破坏；经Nim处理后，DBP+Nim组Nissl小体缺失的现象在给予Nim保护后有所缓解。
| Group | Pre-exposure weight/g | Post-exposure brain coefficient/% |
| Control | 17.86±0.44 | 1.23±0.029 |
| DBP(50 mg·kg-1) | 17.73±0.83 | 1.18±0.031* |
| Nim(2 mg·kg-1) | 16.74±0.38 | 1.29±0.074 |
| DBP+Nim | 17.25±0.59 | 1.21±0.028 |
| *P < 0.05 vs control | ||
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| Fig 3 Hippocampal CA1 of KM mice in different treatment groups by HE and Nissl staining (×400) |
由Tab 3可知，与对照组比较，DBP组小鼠脑海马Cyt C、caspase-3水平明显上升(P < 0.01)；经Nim处理后，与DBP组比较，DBP+Nim组小鼠脑海马Cyt C、caspase-3水平明显下降(P < 0.05)。Fig 4的Hoechst 33258染色结果显示，DBP组小鼠脑海马细胞核或细胞质内可见浓染致密的颗粒块状荧光，数量明显多于对照组，且荧光强度有明显性增加；经Nim处理后，DBP+Nim组小鼠脑海马CA1区荧光强度有所减弱。Fig 5的TUNEL染色结果显示，DBP组小鼠脑海马CA1区带有TUNEL荧光标记的神经元，其数量明显多于对照组；经Nim处理后，与DBP组比较，DBP+Nim组小鼠脑海马CA1区凋亡细胞数量有一定程度减少，凋亡水平明显降低。
| Group | Cyt C/nmol·L-1 | Caspase-3/pmol·L-1 |
| Control | 235.57±28.70 | 15.02±4.39 |
| DBP(50 mg·kg-1) | 424.65±12.85** | 33.37±5.30** |
| Nim(2 mg·kg-1) | 156.42±7.61 | 14.38±3.28 |
| DBP+Nim | 206.59±9.67# | 17.91±2.09# |
| **P < 0.01 vs control; #P < 0.05 vs DBP | ||
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| Fig 4 Hippocampal CA1 of KM mice in different treatment groups by Hoechst 33258 fluorescence staining (×200) A: Control group; B: 50 mg·kg-1 DBP group; C: 2 mg·kg-1 Nim group; D: DBP+Nim group. Yellow arrow: dense granular and massive fluorescence was seen in the nucleus or cytoplasm. |
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| Fig 5 Hippocampal CA1 of KM mice in different treatment groups by TUNEL staining (scale bar=50 μm) A: Control group; B: 50 mg·kg-1 DBP group; C: 2 mg·kg-1 Nim group; D: DBP+Nim group. Red arrow: apoptotic cells with TUNEL-labeled (green). |
细胞凋亡在神经元发育过程中起重要作用，凋亡缺陷可能是各种神经退行性疾病的基础。大脑是接受外源刺激的一个重要靶器官，而海马是学习和记忆的关键功能区，海马神经元的损伤、凋亡以及信号通路的激活等，在导致LD过程中起重要作用[10]。既往研究表明[6]，细胞内钙离子浓度的升高是细胞发生凋亡的一个重要条件。另有研究报道[7]，Nim是一种L型钙通道拮抗剂，能减少病理状态下过度的Ca2+，可明显减轻受试动物的空间学习记忆障碍，抑制海马CA1区神经元的丢失。本实验结果表明，DBP可增加Ca2+浓度，激活PKC-ERK1/2通路，导致KM小鼠脑海马组织CA1区神经元细胞发生凋亡，而Nim作为Ca2+拮抗剂可减少Ca2+浓度，从而抑制ERK1/2通路的活化，降低DBP对KM小鼠脑组织CA1区神经元的损伤及凋亡，具有一定的神经保护作用。
体内外研究均显示[11]，胞内Ca2+浓度与细胞凋亡密切相关。CaM是细胞内一种钙结合蛋白，能敏感地捕获Ca2+，每4个Ca2+可被一分子CaM结合；当胞内游离的Ca2+浓度增加，无活性的CaM结合Ca2+而被活化，激活相关靶蛋白，从而参与介导细胞凋亡、细胞短期和长期记忆等生命活动。CaMKII广泛分布在神经组织中，在海马内约占蛋白总量的1%~2%，它的主要作用是能感受突触后钙离子水平的变化，维持突触可塑性和发挥学习记忆功能。PKC是G蛋白偶联受体系统中的效应物，在未受刺激的细胞中，PKC主要分布在细胞质中，呈非活性构象；一旦有第二信使如Ca2+的存在，PKC将成为膜结合的酶，一方面它能激活细胞质中的酶如ERK1/2，参与生化反应的调控，同时也能作用于细胞核中的转录因子，参与基因表达的调控，在细胞的转录激活等方面具有重要作用。本研究结果显示，50 mg·kg-1 DBP组小鼠脑组织CaM、CaMKII含量明显降低，同时PKC水平增加，提示DBP可致细胞内Ca2+浓度增加，这与蒋昀等[12]报道一致。
ERK1/2通路活化与中枢神经系统的海马组织神经细胞的凋亡有重要关联[13]。Zhai等[13]指出，ERK1/2参与海马突触可塑性的形成，在学习记忆过程中起重要作用。另一方面，ERK1/2通路可被细胞内钙离子信号所激活，直接参与内源性细胞凋亡过程。本实验结果表明，50 mg·kg-1 DBP组小鼠脑海马组织p-ERK1/2蛋白表达水平明显高于对照组，提示DBP可激活ERK1/2通路。
研究证实[14]，Cyt C释放是早期凋亡发生的重要事件，caspase-3是介导细胞凋亡过程中的关键执行分子，两者水平可反映早期细胞凋亡程度。本实验结果表明，50 mg·kg-1 DBP组小鼠脑海马组织Cyt C、caspase-3含量明显高于对照组；HE与Nissl染色结果也显示，50 mg·kg-1 DBP组小鼠脑海马组织CA1区锥体神经元出现了损伤，伴有Nissl小体缺失。根据Hoechst 33258以及TUNEL荧光结果进一步显示，DBP暴露后，小鼠脑海马组织CA1区的细胞凋亡水平明显升高。以上结果提示，DBP暴露可激活caspase-3细胞凋亡途径，导致小鼠脑组织神经细胞的损伤及凋亡。
脑海马CA1区的病理学改变与小鼠神经行为学的变化密切相关，MWM实验主要用于测试实验动物对空间位置感和方向感(空间定位)的学习记忆能力。本实验MWM的结果表明，50 mg·kg-1 DBP组小鼠的逃逸潜伏期明显高于对照组，出现在目标象限的游泳轨迹较少，而经Nim处理后，DBP+Nim组小鼠的学习记忆能力有一定程度改善。其他动物实验表明，Nim可通过抑制胞内Ca2+浓度的增加，下调全脑放疗后细胞凋亡，减轻迟发性认知功能障碍，对记忆障碍有改善作用[15]。本实验结果提示，Nim可能在一定程度上拮抗DBP引起的胞内Ca2+浓度的增加，缓解DBP诱导的脑海马CA1区神经细胞损伤，从而发挥神经保护作用。
综上所述，DBP暴露可影响小鼠脑海马神经细胞内Ca2+相关蛋白，上调p-ERK1/2表达，诱发或加重小鼠的学习记忆障碍。Nim作为一种选择型钙拮抗剂，能改善DBP所致小鼠的学习记忆下降，或与其可拮抗胞内Ca2+浓度增加，降低DBP暴露后小鼠脑组织p-ERK1/2、caspase-3水平有关。
( 致谢: 本实验动物给药操作在湖北科技学院基础医学院完成，感谢暨南大学中医学院陈刚教授的指导。)
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