2. 江苏省中药药效与安全性评价重点实验室，江苏 南京 210023
2. Jiangsu Key Lab for Pharmacology and Safety Evaluation of Chinese Materia Medica, Nanjing 210023, China
肿瘤的发生发展是一个多因素、多步骤、多基因参与的过程，抑癌基因和癌基因是目前肿瘤基因治疗研究的热点。DLC2(deleted in liver cancer 2)是新近发现的抑癌基因，其在多种肿瘤中缺失或者低表达，在肿瘤细胞增殖、细胞凋亡、细胞迁移和侵袭、细胞干性、血管生成等方面发挥重要作用。最近对其作用机制深入研究发现，DLC2可通过竞争性内源RNA (competive endvgenous RNAs, ceRNAs)机制与其他转录体相互调控，该机制进一步拓宽了DLC2在肿瘤发生发展中的作用。该文针对DLC2在肿瘤发生、发展中的作用及机制进行综述，为DLC2抑癌作用机制深入研究，以及将DLC2应用于抗肿瘤治疗的靶点提供一定的思路。
1 DLC2的结构与功能DLC2最初由Ching等[1]于2003年通过代表性差异分析方法，从肝脏组织中克隆获得的抑癌基因，该基因位于染色体13ql2.3。其编码的DLC2蛋白属于DLC蛋白亚家族，该亚家族有3个成员：DLC1、DLC2和DLC3，它们具有相似的蛋白结构域：SAM(sterile alpha motif)、Rho GTP酶激活蛋白(Rho GTPase-activating protein, RhoGAP)和START (StAR-related lipid-transfer)。见Fig 1。
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| Fig 1 Protein domains of DLC2: SAM domain, RhoGAP domain, START domain, and FAT sequences |
SAM结构域位于N′末端，属较保守的蛋白结构域，广泛地存在于从酵母到人类的各种生物。一般认为，蛋白分子借助于SAM结构域相互作用，形成同源或异源的寡聚体，即该结构域通常作为蛋白作用元件发挥其生物学功能。而DLC2的SAM结构域与其他已知的SAM结构域同源性低，一般以单体形式存在，DLC2自缔合也不依赖SAM结构域。此外，DLC2的SAM结构域还有结合脂类的功能[2]。
保守的RhoGAP结构域，位于DLC蛋白的中间部分，是DLC最重要的功能区，因此，DLC亚家族属于RhoGAPs蛋白家族。该结构域主要功能是作为细胞内分子开关，调控Rho GTP酶的活性，将活化的Rho GTP结合蛋白转变为失活的GDP结合状态，从而负性调节Rho GTP酶活性，由此参与黏着斑的形成和细胞骨架的重塑。黏着斑是细胞与胞外基质的主要连接方式，是以整合素为中心的蛋白复合体，整合素的胞外段与细胞外基质结合，整合素的胞内段与肌动蛋白(actin)细胞骨架结合，从而介导细胞与胞外基质结合和信号胞内转导，参与肿瘤细胞黏附、迁移、增殖、分化等过程。黏着斑的形成由Rho GTP酶家族蛋白调控，激活Rho促进黏着斑的形成，抑制Rho则起到相反的作用。细胞骨架是与保持细胞形态结构和细胞运动有关的纤维网络，当细胞骨架或骨架相关蛋白发生突变或表达异常，便会促进肿瘤细胞耐药和转移。与actin相关的信号通路，如Rho GTP酶及下游效应蛋白，均可通过细胞骨架，介导肿瘤细胞迁移、侵袭和转移。与微管相互作用的关键蛋白和细胞骨架actin之间的相互“交流”，在肿瘤转移中受到越来越多的关注，可能为肿瘤转移的治疗提供新的思路[3]。研究表明，DLC2能够通过其保守的RhoGAP结构域调节Rho GTP酶的活性，进而抑制Rho蛋白调节的细胞骨架重塑和Ras诱导的小鼠成纤维细胞变形。
START结构域位于C′末端，含有START结构域的蛋白一般都命名为STARD(START domain contain)，因此，DLC1又名STARD12，DLC2又名STARD13，DLC3又名STARD8。START结构域形成螺旋-发夹结构，可容纳疏水性脂质，参与脂类转运、脂类代谢和代谢相关信号传导。有文献报道，DLC2可通过START结构域，定位于线粒体和胞质内脂滴，提示其可能与脂质参与的能量代谢有关[4]。另有报道，通过酵母双杂交系统发现DLC2与3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶(3-hydroxy-3-methylglutaryl CoA reductase)结合，提示DLC2可能参与脂质合成代谢途径。
此外，位于SAM结构域和RhoGAP结构域之间的318~472氨基酸序列是DLC2能定位于黏着斑必需的最小片段，该序列被命名为黏着斑定位(focal adhesion targeting, FAT)序列。因而，DLC蛋白亚家族也属于黏着斑相关蛋白。
2 DLC2在肿瘤发生发展中的作用作为抑癌基因，DLC2在多种肿瘤中表达下调或缺失，如肝癌、乳腺癌、胶质瘤等。研究表明，其可通过调控细胞生长、细胞运动、细胞形态改变、细胞骨架重组、细胞脂类代谢及肿瘤血管生成等多个过程，抑制肿瘤的发生、侵袭和转移，并改善肿瘤耐药性。本部分详述其在不同肿瘤发生发展中的作用。
2.1 DLC2在肝癌发生发展中的作用在肝癌细胞HepG2中，DLC2通过其RhoGAP活性，抑制Raf-1-ERK1/2-p70S6K通路，从而使肝癌细胞停滞于G1期，抑制肝癌细胞生长和迁移[5]。在HepG2细胞中稳定过表达DLC2，细胞形态会变圆，并能明显抑制细胞增殖、转移和转化，且RhoA活性明显降低。肝癌临床样本中，DLC2低表达，且DLC2水平与肝癌病人总体生存期呈正相关。过表达DLC2，可抑制Rho GTP酶/RhoA/F-actin信号轴，从而抑制转录因子YAP的转录激活功能，进而抑制肝癌细胞干性，并增强其对5-氟尿嘧啶敏感性[6]。
2.2 DLC2在乳腺癌发生发展中的作用Neu转基因小鼠中，如果同时敲除乳腺上皮中DLC2基因，可促进乳腺癌肺转移[7]。miR-125b通过靶向抑制DLC2，促进波形蛋白(vimentin)和α-平滑肌肌动蛋白(α-smooth muscle actin，α-SMA)表达，进而促进乳腺癌细胞MDA-MB-231和MCF-7的转移，miR-125b对α-SMA的调控作用可被ROCK抑制剂阻断，表明miR-125b对α-SMA的调控是由DLC2/RhoA/ROCK通路介导的[8]。我们研究发现，DLC2基因在淋巴结转移阳性的乳腺癌组织中表达较高，而在淋巴结转移阴性的乳腺癌组织中表达较低，且DLC2表达水平与乳腺癌细胞的转移能力呈负相关[9]。尚有研究表明，DLC2缺失可促进基质胶和肿瘤细胞诱导的血管生成反应，在内皮细胞中沉默DLC2可削弱细胞黏附能力，促进细胞迁移和小管形成，这些表型均可被RhoA沉默逆转，表明DLC2对血管生成的调控是通过调节RhoA活性实现的[10]。三阴性乳腺癌细胞MDA-MB-231和MDA-MB-157中，miR-9通过部分靶向抑制STARD13，促进肿瘤细胞出芽和管腔结构形成[11]。
2.3 DLC2在胶质瘤发生发展中的作用DLC2可通过其SAM结构域与TAp73α相互作用，促进TAp73α泛素化降解，进而抑制胶质瘤发展，敲除DLC2的SAM结构域，该作用被取消[12]。de Tayrac等[13]研究表明，抑癌基因DLC2低表达可促进恶性胶质瘤的侵袭，以及恶性胶质瘤对依托泊苷的耐药。另有研究表明，与正常组织相比，DLC2在胶质瘤中低表达，但与Ⅰ级胶质瘤相比，DLC2在Ⅳ级胶质瘤中高表达，即DLC2可抑制胶质瘤增殖，但其对于胶质瘤转移却是必需的[14]。有研究表明，敲除DLC2可增强细胞边缘RhoA活性，抑制Rac活性，增强黏着斑稳定性和细胞黏附，抑制恶性胶质瘤迁移[15]。DLC2在胶质瘤发生、发展过程中是否扮演着不同角色，甚至相反的角色，有待进一步研究。
2.4 DLC2在其它肿瘤发生发展中的作用DLC2能够抑制结肠癌细胞增殖，但却能促进其迁移，与其在胶质瘤中作用类似，因此，DLC2在结肠癌发生、发展过程中的不同作用有待深入研究[16]。Bera等[17]研究表明，miR-125b水平在耐吉西他滨的胰腺癌中异常增高，且miR-125b水平与DLC2呈负相关，提示DLC2可作为增强胰腺癌化疗敏感性和抑制其转移的潜在靶标。
3 DLC2发挥作用的新机制——ceRNA2011年7月由哈佛医学院Pandolfi课题组首次提出[18]，认为所有含有miRNA响应原件的RNA转录体可通过竞争结合相同的miRNAs，进行“交流”，并相互调控。ceRNA赋予了非编码转录体新的功能，在转录体组形成了一个大规模的调控网络，扩大了人类基因组中的功能性遗传信息。目前，对于ceRNA的研究，主要集中在肿瘤方向，并已证实其在多种肿瘤发生、发展中发挥重要作用，如乳腺癌、肺癌、结肠癌、肝癌、胃癌、前列腺癌、黑色素瘤等[19, 20]。
近年来研究表明，DLC2可在转录后水平被调控，从而参与肿瘤发生、发展过程(Fig 2)。本课题组前期研究表明，miR-125b可通过靶向于DLC2 3′-UTR，在转录后水平抑制其表达，从而促进乳腺癌细胞骨架重构，使其表型向间质样转化，进而促进乳腺癌转移，但该作用可被ROCK抑制剂逆转，表明miR-125b是通过DLC2/RhoA/ROCK信号通路发挥作用的，且在该研究中首次证实DLC2为miR-125b的靶基因[8]。进一步研究表明，DLC2通过其3′-UTR区4546-4560 nt处的miR-125b结合位点，抑制miR-125b的活性，进而促进TP53INP1及其下游信号分子SPARC和基质金属蛋白酶MMP-2/9的表达，即DLC2通过扮演TP53INP1的ceRNA，抑制乳腺癌细胞上皮间质转化及转移[21]。DLC2 3′-UTR还可通过扮演抑凋亡蛋白BMF的ceRNA，促进BMF的表达，增强BMF与Bcl-2结合，进而促进促凋亡蛋白Bax的释放，发挥促乳腺癌细胞凋亡的作用[22]。课题组研究表明，DLC2、CDH5、HOXD1、HOXD10之间通过ceRNA机制调控彼此表达水平，从而抑制乳腺癌上皮间质转化及转移，并将该ceRNA网络简称为DLC2相关ceRNA网络[9]。最近研究证实，DLC2相关ceRNA还可通过扮演Hippo通路中关键激酶LATS1/2的“子ceRNA网络”，促进LATS1/2的表达，进而激活Hippo通路，促进下游关键转录因子YAP/TAZ核质转位，削弱YAP/TAZ的转录活性；同时该ceRNA网络还可通过DLC2的RhoGAP活性，抑制RhoA/ROCK1/MLC/F-actin信号通路，促进YAP/TAZ的核质转位，进而抑制YAP/TAZ的转录活性。通过以上两条信号通路，DLC2相关ceRNA网络可抑制乳腺癌细胞的干性。同时还发现，DLC2及其ceRNA在耐阿霉素的乳腺癌细胞中呈低表达，过表达DLC2相关ceRNA可增强乳腺癌细胞对阿霉素的敏感性，且该活性是依赖于miRNAs的[23]。另外，DLC2还可扮演促凋亡蛋白Fas的ceRNA，促进肝癌细胞的凋亡[24]。
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| Fig 2 DLC2 involved in tumorigenesis and progression via ceRNA mechanism |
对于DLC2被调控的机制，课题组进一步证实，趋化因子受体CCR2的3′-UTR还可以通过扮演DLC2的ceRNA促进DLC2的表达，并通过其抑制RhoA/ROCK1通路，发挥抑制乳腺癌转移的功能，且该功能与CCR2蛋白本身的功能相反，这也进一步证实了mRNA的3′-UTR可能发挥与mRNA本身编码的蛋白功能相反的功能[25]。但在我们的研究中，DLC2的3′-UTR功能与DLC2 mRNA编码的蛋白本身功能相一致。另外，课题组成员Zheng等[26]研究还发现，DLC2的表达还受到RNA结合蛋白RNPC1的调控，RNPC1可通过结合DLC2相关ceRNA网络中的CDH5和HOXD10的3′-UTR，增强它们的mRNA稳定性，从而增强它们的表达，进一步促进DLC2及该ceRNA网络中的另外一个成员HOXD1的表达，最终发挥抑制乳腺癌细胞迁移的作用。Zhou等[27]通过染色质免疫共沉淀及荧光素酶报告法研究发现，HOXB4(Homeobox B4)可直接作用于DLC2的启动子，从而增强DLC2的转录活性及其表达，通过抑制RhoA/ROCK1通路，抑制乳腺癌细胞的迁移，并增强乳腺癌细胞对化疗药物阿霉素的敏感性。
4 总结与展望综上所述，DLC2主要通过其保守的RhoGAP及SAM结构域发挥抑癌作用，可调控肿瘤细胞生长、细胞运动、细胞形态改变、细胞骨架重组、细胞脂类代谢及肿瘤血管生成等多个过程，从而抑制肿瘤的发生、侵袭、转移。另外，作为miRNAs靶标，DLC2可在转录后水平被调控，并通过ceRNA机制与其他基因相互调控，参与调控肿瘤的凋亡、转移、干性、耐药性等，进一步扩大了DLC2的功能。未来研究应进一步剖析DLC2在肿瘤发生、发展中的分子机制及其被调控机制，挖掘促进DLC2表达的药物，作为协同化疗的辅助治疗手段。此外，DLC2的抗肿瘤作用及其在肿瘤中的低表达赋予它作为肿瘤生物标志物的新角色，可为临床进行基因诊断和治疗及预后监测提供新的思路。
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