2. 广州中医药大学第二临床医学院 珠海医院药剂科，广东 广州 510120
2. Pharmacy Dept of Zhuhai Hospital, Second Clinical Medical College Affiliated to Guangzhou University of Chinese Medicine, Guangzhou 510120, China
士的宁(strychnine，STR)和马钱子碱(brucine，BRU)作为中药马钱子的主要药效生物碱成分，具有明显的镇痛[1-2]、抗炎[3-4]、抗肿瘤[5-7]、中枢神经系统兴奋[8-9]等多种药理活性。研究表明，其代谢产物士的宁氮氧化物(strychnine N-oxide，SNO)和马钱子碱氮氧化物(brucine N-oxide，BNO)的毒性比原型物大大降低，且具有较好的生物活性。目前，关于4种成分的组织测定方法主要包括高效液相色谱法(HPLC)，但存在分析时间长、灵敏度较低、专属性和特异性不强等缺点[10-11]。本研究旨在建立快速、灵敏、准确的液相色谱-质谱联用法(LC-MS/MS)，同时测定大鼠组织中STR、BRU、SNO和BNO的含量，比较正常和毒性剂量马钱子总碱给药后，4种成分的组织分布情况，为其在生物体内的代谢动力学研究提供测定方法，并为其毒性机制和药理作用研究等提供更准确、可靠的科学依据。
1 材料 1.1 药品与试剂士的宁对照品(批号131030)、马钱子碱对照品(批号131040)，成都普菲德生物技术有限公司；士的宁氮氧化物对照品(批号S450162)、马钱子碱氮氧化物对照品(批号S450142)，Sigma-Aldrich公司；盐酸麻黄碱对照品(批号0714-9402)，中国药品生物制品检定所，对照品纯度均＞98%。乙醇为分析纯；甲酸、乙酸铵、甲醇，均为HPLC色谱纯；水为Milli-Q超纯水；马钱子总碱由南京中医药大学药剂实验室馈赠，其中士的宁占33.33%，马钱子碱占21.28%。
1.2 仪器SHIMADZULC-20A高效液相色谱(日本岛津公司)；API4000+型液相色谱-三重四级杆质谱联用仪(LC-MS/MS)，配备Turbo Ionspray离子源(ESI)及Analyst 1.6数据处理系统(美国AB Sciex公司)；Thermo SPD121P P1真空离心浓缩仪(美国Thermo Fisher公司)；BF2000-30A氮气吹干仪(北京八方世纪科技有限公司)；Microfuge 16台式微量离心机(美国Beckman Coulter公司)。
1.3 实验动物SPF级SD大鼠，♂，体质量(225±25)g，购于广东省医学实验动物中心，合格证号：(粤)44007200008985。实验前禁食12 h以上，自由饮水。
2 方法 2.1 色谱与质谱条件色谱条件：色谱柱为ZORBAX Eclipse XDB-C18柱(2.1 mm×150 mm，3.5 μm)；流动相A为10 mmol·L-1乙酸铵(用甲酸调pH 4.0)，流动相B为甲醇，梯度洗脱：B相0~1 min，5%；1~6.5 min, 5%~70%；6.5~7.5 min，70%；7.5~7.6 min，70%~5%；7.6~11 min，5%，流速0.2 mL·min-1；柱温30 ℃，进样量5 μL。
质谱条件：电喷雾ESI离子源，检测方式为正离子多离子反应检测(MRM)；喷雾电压为5500 V；雾化温度为350 ℃。其他质谱参数设置分别为：碰撞气(CAD)12 psi；雾化气(GAS1)20 psi；帘气(CUR)40 psi；用于定量分析的离子对分别为m/z 335.3→184.1(士的宁)，395.3→324.3(马钱子碱), 351.4→334.1(士的宁氮氧化物)，411.2→394.2 (马钱子碱氮氧化物)，166.2→148.3(内标盐酸麻黄碱)。
2.2 溶液的制备分别精密称取STR、BRU、SNO和BNO 1.05 mg、1.17 mg、1.06 mg和1.17 mg，甲醇溶解，配成浓度分别为105、117、106、117 mg·L-1的储备液。精密称取盐酸麻黄碱(IS)1.39 mg，甲醇溶解，得到终浓度为139 μg·L-1的内标工作液。精密称取适量马钱子总碱，PBS :乙醇=80 :20溶解，配成浓度0.3 g·L-1的溶液。以上溶液均于4 ℃冷藏备用。
2.3 组织匀浆样本处理各组织样品称重，以质量体积比1 :3的比例加入超纯水，匀浆。精密移取内标工作液(139 μg·L-1)20 μL，常温真空浓缩后加入组织匀浆200 μL，震荡涡旋30 s混匀，加入40 μL氨水碱化，涡旋30 s，加入4 mL氯仿，充分涡旋2 min，3 750 r·min-1离心10 min，取下层有机相于35 ℃下N2吹干，使用200 μL流动相[甲醇:10 mmol·L-1乙酸铵(用甲酸调pH 4.0)=40 :60]复溶，涡旋2 min，14 000 r·min-1离心15 min，过滤，取上清液进行分析，进样量5 μL。
2.4 给药与组织样品采集SD大鼠随机分为正常和毒性剂量组，每组25只。每组大鼠按时间点随机分成5组，每个时间点5只。正常和毒性剂量组分别灌胃马钱子总碱溶液1.2 mg·kg-1(STR 0.4 mg·kg-1，BRU 0.2554 mg·kg-1)和3.0 mg·kg-1(STR 1 mg·kg-1，BRU 0.6385 mg·kg-1)，分别于给药后5、15、30、60、120 min麻醉，分离心、肝、脾、肺、肾和脑，脏器用超纯水洗净，滤纸吸干，于-80 ℃保存。
3 结果 3.1 专属性分别取来自6只大鼠的空白肾组织匀浆(以肾组织为代表)，空白肾组织匀浆加4种待测物和内标，以及大鼠灌胃给药后的肾组织匀浆样品，按照“2.3”项下操作，在选定的检测条件下考察5种分析成分。Fig 1结果显示，STR、BRU、SNO、BNO和内标的保留时间分别为8.31、8.33、8.86、8.82、7.56 min，组织中内源性物质不会对待测成分产生干扰，峰形良好。
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| Fig 1 Representative MRM chromatograms A: Blank kidney homogenate; B: Blank kidney homogenate spiked with analytes and IS; C: Kidney homogenate obtained from a rat after intragastric administration of Semen Strychni total alkaloids. |
分别精密吸取适量STR、BRU、SNO和BNO储备液，用甲醇逐级稀释成系列标样，精密吸取200 μL标样，真空浓缩，分别加入到200 μL空白大鼠组织匀浆中，按“2.3”项下操作，分别以STR、BRU、SNO和BNO与内标盐酸麻黄碱的峰面积比值对各自相应的浓度进行加权(1/X2)线性回归。定量下限(LLOQ)为标准曲线的最低浓度。所得回归方程及定量下限见Tab 1，各成分在测定范围内线性关系良好。
| Tissue | Analyte | Calibration curve | r | Linear range/μg·L-1 | LLOQ/μg·L-1 |
| Kidney | STR | Y=3.12×10-3X+3.77×10-4 | 0.9960 | 1.02-450 | 1.02 |
| BRU | Y=2.63×10-3X+1.81×10-3 | 0.9945 | 1.02-451 | 1.02 | |
| SNO | Y=3.83×10-3X+7.97×10-4 | 0.9990 | 0.307-135 | 0.306 | |
| BNO | Y=1.42×10-2X+1.39×10-3 | 0.9977 | 0.307-135 | 0.306 | |
| Liver | STR | Y=5.88×10-3X+1.65×10-3 | 0.9942 | 1.02-450 | 1.02 |
| BRU | Y=2.94×10-3X+2.36×10-3 | 0.9959 | 1.02-451 | 1.02 | |
| SNO | Y=1.3×10-3X+1.13×10-3 | 0.9969 | 0.307-135 | 0.306 | |
| BNO | Y=6.78×10-3X+1.99×10-3 | 0.9968 | 0.307-135 | 0.306 | |
| Heart | STR | Y=2.76×10-3X+1.15×10-3 | 0.9974 | 1.02-450 | 1.02 |
| BRU | Y=1.26×10-3X+1.03×10-3 | 0.9986 | 1.02-451 | 1.02 | |
| SNO | Y=2.9×10-3X+5.61×10-4 | 0.9986 | 0.307-135 | 0.306 | |
| BNO | Y=1.23×10-2X+2.18×10-3 | 0.9990 | 0.307-135 | 0.306 | |
| Lung | STR | Y=3.16×10-3X+1.68×10-3 | 0.9985 | 1.02-450 | 1.02 |
| BRU | Y=1.42×10-3X+1.02×10-3 | 0.9948 | 1.02-451 | 1.02 | |
| SNO | Y=3.44×10-3X+1.12×10-3 | 0.9940 | 0.307-135 | 0.306 | |
| BNO | Y=1.25×10-2X+4.6×10-4 | 0.9994 | 0.307-135 | 0.306 | |
| Spleen | STR | Y=3.15×10-3X+9.76×10-4 | 0.9968 | 1.02-450 | 1.02 |
| BRU | Y=1.38×10-3X+1.21×10-3 | 0.9966 | 1.02-451 | 1.02 | |
| SNO | Y=3.19×10-3X+4.59×10-4 | 0.9990 | 0.307-135 | 0.306 | |
| BNO | Y=1.33×10-2X+1.44×10-3 | 0.9987 | 0.307-135 | 0.306 | |
| Brain | STR | Y=3.19×10-3X+2.44×10-3 | 0.9996 | 1.02-450 | 1.02 |
| BRU | Y=1.46×10-3X+1.61×10-3 | 0.9939 | 1.02-451 | 1.02 | |
| SNO | Y=3.49×10-3X+1.13×10-3 | 0.9987 | 0.307-135 | 0.306 | |
| BNO | Y=1.45×10-2X+3.71×10-3 | 0.9975 | 0.307-135 | 0.306 |
分别配制低、中、高浓度的质控样品：STR 3.00、30.03、390.39 μg·L-1，BRU 3.01、30.10、390.90 μg·L-1，SNO 0.901、9.01、117.13 μg·L-1，BNO 0.901、9.01、117.12 μg·L-1，按“2.3”项下操作，每个质量浓度平行5份，连续测定3 d，以当天随行的标准曲线测定质控样品浓度。结果显示，心、肝、脾、肺、肾、脑组织中的相对回收率和日内、日间精密度分别为STR：(87.66±1.01)%~(112.51±3.40)%、2.13%~9.31%、1.29%~14.70%；BRU：(87.16±1.07)%~(110.49±1.74)%、2.83%~9.36%、1.34%~14.13%；SNO：(86.84±1.71)%~(113.77±5.19)%、2.14%~10.02%、0.34%~14.90%；BNO：(85.94±1.43)%~(113.29±5.46)%、2.05%~9.31%、0.90%~14.30%。均符合生物样品分析的方法学要求。
3.4 提取回收率及基质效应按“3.3”项下操作，配制低、中、高3个浓度水平的STR、BRU、SNO、BNO组织质控样品(以肾组织为代表)，每个浓度平行操作5份，按“2.3”所述操作，进样考察，峰面积记作A1；取空白组织匀浆同样操作，N2吹干后残渣分别加入相应低、中、高浓度的对照品溶液复溶，进样考察，峰面积记作A2，以A1/A2×100%为提取回收率(Tab 2)。分别配制含有低、中、高浓度STR、BRU、SNO、BNO的混合标准品溶液，直接进样，峰面积记作A3，以A2/A3×100%为基质效应，见Tab 2。
| Analyte | Added concentration/μg·L-1 | Recovery/% | RSD/% | Matrix effect/% | RSD/% |
| STR | 3 | 98.80±11.29 | 11.40 | 110.00±10.29 | 9.39 |
| 30 | 95.80±11.94 | 12.50 | 99.80±4.27 | 4.27 | |
| 390 | 110.00±6.48 | 5.88 | 93.70±4.51 | 4.81 | |
| BRU | 3.01 | 96.50±7.83 | 8.11 | 105.00±7.54 | 7.21 |
| 30.1 | 93.70±9.17 | 9.79 | 102.00±3.34 | 3.28 | |
| 391 | 105.00±9.85 | 9.40 | 98.40±7.94 | 8.07 | |
| SNO | 0.9 | 81.60±4.03 | 4.94 | 98.80±7.83 | 7.93 |
| 9 | 79.20±8.54 | 10.80 | 98.00±6.74 | 6.88 | |
| 117 | 79.80±8.04 | 10.10 | 94.20±4.84 | 5.14 | |
| BNO | 0.9 | 86.50±6.43 | 7.43 | 98.70±1.16 | 1.18 |
| 9 | 84.90±6.13 | 7.23 | 103.00±4.12 | 4.02 | |
| 117 | 85.50±7.79 | 9.11 | 98.70±5.86 | 5.94 |
按“3.3”项下操作，配制低、中、高3个浓度STR、BRU、SNO、BNO的质控样品(以肾组织为代表)，每个浓度5个样本，分别考察样品在室温放置4 h，反复冻融3次，以及制备好的待测液4 ℃放置12 h条件下的稳定性。Tab 3结果表明，4种成分在上述条件下均较为稳定。
| Analyte | Added concentration/μg·L-1 | Accuracy/% | ||
| Short-term stability(4 h) | Three freeze-thaw cycles stability | Autosampler stability(4 ℃，12 h) | ||
| STR | 3 | 99.67±8.86 | 95.57±6.64 | 102.00±3.88 |
| 30 | 109.21±2.22 | 106.10±2.36 | 110.60±2.77 | |
| 390 | 98.67±3.39 | 98.67±0.61 | 90.93±1.80 | |
| BRU | 3.01 | 90.76±10.51 | 92.06±7.27 | 108.47±7.17 |
| 30.1 | 111.11±2.05 | 106.24±2.59 | 108.49±2.26 | |
| 391 | 98.16±3.15 | 99.63±1.54 | 91.35±2.09 | |
| SNO | 0.9 | 109.88±6.11 | 106.66±7.74 | 106.88±2.02 |
| 9 | 103.28±1.77 | 103.27±3.41 | 110.18±3.23 | |
| 117 | 92.45±3.25 | 97.88±1.93 | 96.75±3.17 | |
| BNO | 0.9 | 110.08±6.38 | 110.81±3.86 | 108.89±7.03 |
| 9 | 101.45±2.52 | 100.58±2.15 | 108.80±3.28 | |
| 117 | 89.13±2.19 | 93.22±0.81 | 95.89±1.66 | |
大鼠单次灌胃马钱子总碱溶液正常和中毒剂量后，正常剂量组STR在各组织中含量排列顺序为：肾>脾>肝>肺>心>脑(Fig 2A)，毒性剂量组的顺序依次为：肾>肝>肺>脾>心>脑(Fig 2B)；正常剂量组BRU含量依次为(Fig 3A)：肾>肝>脾>肺>心>脑，毒性剂量组的含量依次为：肝>肾>脾>肺>心>脑(Fig 3B)；正常剂量和毒性剂量组SNO含量依次为：脾>肝>肾>肺(Fig 4)。代谢产物BNO浓度低于定量限。
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| Fig 2 Tissue distribution of strychnine in rats following single intragastric administration of total alkaloids from Semen Strychni(x±s, n=5) A:Normal dose; B: Toxic dose. |
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| Fig 3 Tissue distribution of brucine in rats following single intragastric administration of total alkaloids from Semen Strychni(x±s, n=5) A: Normal dose; B: Toxic dose. |
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| Fig 4 Tissue distribution of strychnine N-oxide in rats following single intragastric administration of total alkaloids from Semen Strychni(x±s, n=5) A: Normal dose; B: Toxic dose. |
本文建立了LC-MS/MS同时测定大鼠心、肝、脾、肺、肾、脑组织中马钱子碱、士的宁及其氮氧化物含量的分析方法，以10 mmol·L-1乙酸铵(用甲酸调pH=4.0)-甲醇为流动相进行梯度洗脱，内源性杂质干扰小，峰形对称，分离度好；采用正离子多离子反应检测，质谱响应及灵敏度高。在样品前处理条件优化过程中，比较了不同处理方法(甲醇沉淀法、氯仿液液萃取法)，并进一步考察了氯仿多步和一步液液萃取，及氯仿体积(3、4 mL)对4种待测物提取回收率的影响。另外，由于马钱子碱和士的宁均为碱性药物成分，因此，采用氨水碱化生物样品[12]，提高提取效率。
组织分布结果显示，正常和毒性马钱子总碱剂量下，STR和BRU在大鼠主要脏器中分布相似，其中以肝脏和肾脏最高，脾脏浓度也较高，脑中的分布量最少。提示STR和BRU可能存在肝脏的代谢或胆汁排泄；肾脏很可能是其主要的排泄途径；脾脏浓度较高，推测这与其具有免疫调节的作用可能有关；STR和BRU均能透过血脑屏障，但透过能力有限。
两种剂量给药后，SNO在主要脏器中均能检出(脑、心除外)，但是浓度较低，远低于STR原型物，说明在体内STR确实可转化成SNO，但STR可能不是以SNO的形式在体内蓄积。BRU在体内可代谢成BNO[13-14]，本实验仅在毒性剂量给药后的个别肝脏样品中测到，但测得的BNO浓度低于定量下限。
综上所述，本研究建立了灵敏、快速和准确的LC-MS/MS法测定STR、BRU、SNO和BNO，基于该法比较了正常和毒性剂量马钱子总碱给药后，4种成分在大鼠组织中的分布特征，为其在生物体内的代谢动力学研究奠定了基础，并对阐明其药理毒理机制有重要意义。
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