肝纤维化是肝脏组织细胞外基质(extracellular matrix，ECM)异常增生和过度沉积的病理性变化[1]，是所有慢性肝病的必经过程[2]。目前认为，肝纤维化是可逆的，而肝硬化、肝癌不可逆。因此，防治肝纤维化具有重要意义。抑制肝星状细胞(hepatic stellate cells，HSCs)的活化、促进其凋亡是目前抗纤维化的主要研究策略。线粒体通路是细胞凋亡的主要途径之一，激活的caspase-9即cleaved caspase-9是启动细胞凋亡的关键蛋白[3]，体内实验表明，升高cleaved caspase-9的蛋白表达水平可触发细胞凋亡[4]。
丹参是治疗肝纤维化的传统中药，近年来其水溶性有效成分丹酚酸B(salvianolic acid B，Sal B)在慢性肝病治疗中得到了广泛应用[5]。体内实验表明，Sal B具有延缓二乙基亚硝胺(diethylnitrosamine，DEN)诱导小鼠肝纤维化－肝细胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)进程的作用[6]。体外实验表明，Sal B可抑制HSC中转化生长因子β1(transforming growth factor β1，TGF-β1)表达及其激酶的活性，来抑制体外培养的原代大鼠HSC增殖[7], 抑制内源性TGF-β1的表达逆转肝纤维化[8]。
目前，Sal B对体内外HSC的抑制活化[9]及增殖作用均有报道，其抗纤维化、延缓HCC进程与调控TGF-β1/Smad通路、p-Smad3C/3L有关[6]。然而，从细胞凋亡角度观察Sal B对外源性TGF-β1刺激的HSC-T6(来源于大鼠的活化的HSCs)的影响及其对凋亡蛋白cleaved caspase-9的影响，尚未见报道。我们推测，Sal B抗肝纤维化作用可能与促进体内、体外HSCs凋亡，调控cleaved caspase-9有关。本实验采用DEN诱导小鼠肝纤维化模型, 并结合体外培养HSC-T6，从细胞凋亡角度探讨Sal B对体内外肝纤维化细胞的影响，并探究Sal B对凋亡蛋白cleaved caspase-9的影响。
1 材料与方法 1.1 材料 1.1.1 药物与试剂Sal B(纯度≧95%，批号：PS12091001)、秋水仙碱(colchicine，Col)(纯度≧98%，批号：PS08092201)，购于成都普思生物科技有限公司；DEN(0.95 kg·L-1)购于美国Sigma公司；TGF-β1，购于Peprotech公司；AnnexinV-FITC/PI凋亡检测试剂盒、Hoechst 33258荧光染液、Western及IP细胞裂解液、兔抗Cleaved caspase-9单克隆抗体，均购自上海碧云天生物技术有限公司; 小鼠抗β-actin单克隆抗体、辣根过氧化物酶标记山羊抗兔IgG、辣根过氧化物酶标记山羊抗小鼠lgG，均购自北京中杉金桥。
1.1.2 实验动物与细胞株50只健康♂昆明系小鼠，SPF级，体质量(20±2)g, 由安徽医科大学实验动物中心提供，许可证号：sexk(皖)2011-002。大鼠肝星状细胞株HSC-T6，购于中国科学院上海细胞库，于37 ℃、5% CO2、饱和湿度的无菌培养箱中培养。
1.1.3 仪器JA1003电子天平(上海精科仪器有限公司)；荧光倒置显微镜(日本Olympus公司)；LEICA RM2035型生物组织切片机(湖北孝感市亚光医用电子技术公司)；超净工作台(苏州净化设备有限公司)；Napco-6100型CO2培养箱(美国杜邦公司)；流式细胞仪(美国BD公司)。
1.2 方法 1.2.1 肝纤维化模型的制备及Sal B干预适应性饲养7 d后，将50只小鼠随机分为5组：正常组、模型组、Sal B低、高剂量(15、30 mg·kg-1)组、阳性药秋水仙碱(0.2 mg·kg-1)组, 每组10只。正常组小鼠注射无菌的生理盐水，其余4组注射1.0% DEN溶液来诱导肝纤维化模型，每组按照体质量10 mL·kg-1腹腔注射给药，同一时间每周1次，共12周。在此基础上，Sal B低、高剂量组及阳性药秋水仙碱组于造模当天开始灌胃，正常组小鼠给予相应溶媒灌胃，每天同一时间段给药至12周末。于12周末处死小鼠，取材，按照步骤进行组织的固定、病理检测以及蛋白表达检测。
1.2.2 HSC-T6细胞株的培养、分组及TGF-β1干预HSC-T6培养于含有10%胎牛血清的DMEM高糖培养基中，置于37 ℃、5% CO2饱和湿度的培养箱中无菌培养。每2~3 d传代，细胞状态良好时消化，6孔板中培养至对数生长期。实验分为6组：对照组、TGF-β1组、Sal B组(Sal B 25、50、100 μmol·L-1+TGF-β1)、Sal B对照组(Sal B 50 μmol·L-1)。待6孔板内细胞处于对数生长期，将培养基更换为无血清的DMEM，继续培养24 h, 避光环境下配制低、中、高浓度Sal B溶液(现配现用)，于Sal B组和Sal B对照组加入相应浓度的Sal B，继续培养24 h, 终止培养前6 h，于TGF-β1组和Sal B组加入TGF-β1(9 pmol·L-1)。
1.2.3 HE染色法评估病理学特征并确定纤维化病变区域小鼠腹部正中切口，无菌条件下打开腹腔，摘除整个肝脏，选取小鼠肝脏左叶，采用4%多聚甲醛固定，常规步骤进行梯度乙醇脱水，浸蜡，石蜡包埋, 4 μm切片，烤片，脱蜡，苏木精-伊红(HE)染色。常规步骤脱水，透明，干燥，中性树胶封固。按照标准实验操作规范，使用数字扫描仪显微镜，每组随机拍摄图片10张，请病理老师阅片，确定纤维化病变程度。
1.2.4 Hoechst 33258荧光染色法检测细胞凋亡情况切片梯度乙醇脱蜡后，用PBS或0.9% NaCl洗2遍，每次3 min，吸尽切片上的液体后，于玻片侧边轻轻滴加0.5 mL Hoechst 33258染色液，倾斜玻片，让染色液慢慢浸过组织切片表面，避光均匀染色5 min，PBS清洗2遍去除染色液。染色后吸尽表面液体，滴加抗荧光猝灭液于组织切片上，镊子夹取洁净盖玻片盖上，避光环境下，在荧光显微镜下观察和拍摄图片，每个样本随机拍摄10张，保持曝光度和对比度一致。
1.2.5 流式细胞术检测HSC-T6细胞凋亡率将培养至对数生长期的HSC-T6细胞均匀种于6孔板内，更换为无血清的DMEM培养基，Sal B组分别加入浓度为25、50、100 μmol·L-1的Sal B，Sal B对照组加50 μmol·L-1的Sal B，37 ℃继续培养24 h, 终止培养前6 h，于Sal B组和TGF-β1组加TGF-β1进行干预。用不含EDTA的胰酶消化离心后，收集细胞，调整细胞浓度为1.0×109·L-1, 冷PBS洗涤细胞2次后，分别加入400 μL Annexin V结合液和5 μL Annexin V-FITC染色液，轻轻混匀后，于2~8 ℃孵育15 min，加入5 μL PI染色液混匀后，于2~8 ℃孵育5 min。染色完成后用流式细胞仪上机检测，采用Flowjo软件进行分析，实验重复3次。
1.2.6 Western blot法检测小鼠肝组织和HSC-T6中cleaved caspase-9蛋白的表达常规方法分别提取小鼠肝组织和HSC-T6细胞中的蛋白，采用BCA法定量样本蛋白浓度，PBS缓冲液调整各样本蛋白提取液至同一浓度水平。常规步骤进行SDS-PAGE电泳、转膜、5%脱脂奶粉封闭，分别以抗β-actin、cleaved caspase-9抗体，4 ℃孵育过夜，TBST洗膜3次，每次10 min，继而以相应的辣根过氧化物酶标IgG常温孵育120 min，TBST洗膜3次, 每次10 min, ECL法曝光显影。采用Image J软件进行灰度值分析，结果以目的蛋白与内参蛋白β-actin条带的灰度值比值表示。
1.2.7 统计学分析计量资料数据均用x±s表示，采用SPSS 16.0软件对实验数据进行统计学分析，多组均数之间比较采用单因素方差分析，均数间两两比较采用LSD-t检验。
2 结果 2.1 Sal B对DEN诱导的纤维化小鼠肝组织病理学的影响Fig 1的HE染色结果显示，12周时正常组小鼠肝小叶结构完整，有肝小叶和汇管区、肝细胞的细胞核呈圆形，着色较浅，位于细胞中央。与正常组比较，模型组纤维化程度明显，表现为细胞大小不一，能清楚地观察到肝小叶被分隔成假小叶，提示DEN诱导小鼠12周为肝纤维化时期。Sal B低、高剂量组纤维化程度均轻于模型组，且未形成假小叶结构。HE染色结果提示，Sal B能够改善DEN诱导的肝纤维化期小鼠肝组织病理学变化，并确定纤维化病变区域。
|
| Fig 1 Effect of Sal B on hepatic fibrosis in DEN induced mice(HE, ×100) |
在HE染色确定纤维化病变区域的基础上，采用Hoechst 33258荧光染色法对同一区域进行染色。如Fig 2所示，低倍镜下，正常组呈现弥散均匀的蓝色荧光，模型组呈现较浅的絮状蓝色；与模型组相比，Sal B低、高剂量组在纤维化病变区域呈现明显的蓝白色荧光。高倍镜下，正常组肝细胞核呈圆形或椭圆形，呈现弥散均匀的蓝色，致密浓染的颗粒状荧光为凋亡细胞核，凋亡细胞均匀分布在组织中；模型组高倍镜下呈现浅蓝色，大量细胞核形态不规则，失去正常形态，仅发现少量荧光碎片；与模型组相比，Sal B低、高剂量组在纤维化区域呈现大面积的致密浓染的荧光，其中高剂量组高倍镜下荧光强度最大，提示Sal B能够有效促进纤维化区域的细胞凋亡，尤以高剂量最佳。
|
| Fig 2 Effect of Sal B on apoptosis of liver tissues in DEN induced fibrotic mice(Hoechst 33258 staining) |
如Fig 3所示，与正常组相比，模型组小鼠肝组织中cleaved caspase-9蛋白表达量降低；与模型组比较，Sal B低、高剂量组cleaved caspase-9表达明显升高。提示Sal B能够明显升高肝纤维化组织中cleaved caspase-9的表达水平。
|
| Fig 3 Effect of Sal B on cleaved caspase-9 proteinexpression in liver fibrosis(x±s, n=3) ##P < 0.01 vs control; **P < 0.01 vs Model |
流式细胞术检测结果显示(Fig 4)，TGF-β1组与对照组相比，凋亡率明显下降(P＜0.01)，提示TGF-β1抑制HSC-T6的凋亡。Sal B药物对照组与对照组相比，凋亡率上升，提示Sal B有促凋亡的作用(P＜0.01)。Sal B组(TGF-β1+Sal B 25、50、100 μmol·L-1)与TGF-β1组相比，凋亡率上升，且呈现浓度依赖性(P＜0.01)，提示Sal B对经TGF-β1刺激的HSC-T6仍有促进凋亡的作用。
|
| Fig 4 Effect of Sal B on apoptosis of HSC-T6 cells(x±s, n=3) A:Apoptotic rates of HSC-T6 by flow cytometry; B:Effect of Sal B on apoptotic rate of HSC-T6.##P < 0.01 vs control; **P < 0.01 vs TGF-β1;▲▲P < 0.01 vs Sal B 50 μmol·L-1. |
Fig 5的Western blot结果显示，与对照组相比，TGF-β1组cleaved caspase-9蛋白表达量降低(P＜0.01)，药物对照组(Sal B 50 μmol·L-1)的凋亡率上升(P＜0.01)，提示TGF-β1降低cleaved caspase-9的表达，Sal B升高cleaved caspase-9表达水平；与TGF-β1组相比，Sal B组(TGF-β1+Sal B 50 μmol·L-1)cleaved caspase-9蛋白表达量明显升高(P＜0.01)，提示Sal B能够升高TGF-β1刺激的HSC-T6中cleaved caspase-9的表达水平。
|
| Fig 5 Effect of Sal B on expression of cleaved-caspase-9in HSC-T6 cells stimulated by TGF-β1(x±s, n=3) ##P < 0.01 vs control; **P < 0.01 vs TGF-β1;▲▲P < 0.01 vs Sal B 50 μmol·L-1 |
肝纤维化是肝硬化、肝癌等肝病发生的关键环节，目前已有大量肝纤维化动物实验证实，肝纤维化是一种可逆的瘢痕修复反应，在其形成过程中进行适当干预可阻断，甚至逆转肝纤维化[10]。本实验采用DEN腹腔注射给药诱导肝纤维化模型，实验结果表明，12周末小鼠肝脏切片模型组HE染色能够发现明显的假小叶结构，具备肝纤维化的基本特征，提示DEN诱导小鼠肝纤维化模型制备成功。
肝纤维化主要由于ECM过度沉积所致，而活化的HSC是ECM的主要来源，HSC活化为成纤维样细胞是公认的肝纤维化进展中的重要环节[11]，因而通过促进活化的HSC凋亡是目前研究抗纤维化的热点，但是在组织中我们无法直接辨认出凋亡的是否是HSC。因此，本实验采用HE染色来确定纤维化的病变区域，在同一区域采用Hoechst 33258进行荧光染色检测细胞凋亡情况。结果显示，Sal B低、高剂量组与模型组相比，纤维化病变区域呈致密浓染的颗粒状荧光明显增多，即凋亡的纤维化细胞明显增多，提示Sal B促进纤维化肝组织中活化的HSC细胞凋亡。
本实验采用HE、Hoechst 33258两种染色方式，在体内的细胞水平上提示了Sal B促进HSC的凋亡，为进一步探究Sal B可能的促凋亡机制，采用体外培养活化的肝纤维化细胞HSC-T6，Annexin V-FITC/PI双染法检测凋亡率。结果提示，TGF-β1可明显抑制HSC-T6凋亡，Sal B可促进经TGF-β1刺激的HSC-T6的凋亡，且随着药物浓度的增加，凋亡率也随之增加。体内外实验结果均提示，Sal B能够明显促进体内外HSC凋亡。
细胞凋亡关联到一系列调控因子，主要受细胞内凋亡蛋白的调控，pro-caspase-9是线粒体通路的启动者，线粒体释放细胞色素C后，pro-caspase-9可以与细胞色素C及信号接头分子Apaf-1结合并形成复合物，同时自身被剪切为cleaved caspase-9，cleaved caspase-9进一步激活下游的凋亡执行者caspase-3，进行一系列级联反应，从而导致细胞凋亡的发生[11-12]。本实验检测了Sal B对小鼠肝纤维化组织及HSC-T6细胞中cleaved caspase-9蛋白表达的影响。体内实验结果表明，与模型组相比，Sal B低、高剂量组均能够明显上调cleaved caspase-9的表达；体外实验结果表明，TGF-β1能够下调cleaved caspase-9蛋白表达，Sal B组(TGF-β1+Sal B 50 μmol·L-1)可明显上调cleaved caspase-9的表达，体内外实验均提示Sal B促肝纤维化细胞凋亡与上调cleaved caspase-9表达相关。
综上，Sal B能够有效促进体内外HSCs的凋亡，其促凋亡机制可能与上调cleaved caspase-9蛋白表达有关。本实验为进一步明确Sal B抗肝纤维化的机制研究提供了依据，为临床治疗提供帮助。
| [1] |
Ralf W, Frank T. Liver fibrosis: from pathogenesis to novel therapies[J]. Dig Dis, 2016, 34(4): 410-22. doi:10.1159/000444556 |
| [2] |
蔡卫民. 抗肝纤维化治疗研究的若干问题[J]. 临床肝胆病杂志, 2011, 27(3): 225-32. Cai W M. Several problems in the study of antihepatic fibrosis therapy[J]. J Clin Hepatol, 2011, 27(3): 225-32. doi:10.3969/j.issn.1001-5256.2011.03.001 |
| [3] |
杨涛, 费振海, 钟兴明. Caspase家族与细胞凋亡的研究进展[J]. 浙江医学, 2018, 40(18): 2083-7, 2091. Yang T, Fei Z H, Zhong X M. Research progress of Caspase family and apoptosis[J]. Zhejiang Med J, 2018, 40(18): 2083-7, 2091. doi:10.12056/j.issn.1006-2785.2018.40.18.2017-950 |
| [4] |
Bahman A A, Abaza M S I, Khoushiash S I, et al. Sequence-dependent effect of sorafenib in combination with natural phenolic compounds on hepatic cancer cells and the possible mechanism of action[J]. Int J Mol Med, 2018, 42(3): 1695-715. |
| [5] |
赵先, 王婧雯, 陆杨, 等. 丹酚酸B药理作用的研究进展[J]. 西北药学杂志, 2015, 30(1): 107-10. Zhao X, Wang J W, Lu Y, et al. Advances in pharmacological action of salvianolic acid B[J]. Northwest Pharm J, 2015, 30(1): 107-10. doi:10.3969/j.issn.1004-2407.2015.01.032 |
| [6] |
马滢, 方萌, 伍超, 等. 丹酚酸B调控pSmad3C/pSmad3L发挥抗肝纤维化-肝细胞癌作用[J]. 中国药理学通报, 2018, 34(1): 44-50. Ma Y, Fang M, Wu C, et al. Salvianolic acid B regulates pSmad3C/pSmad3L to play an anti-fibrosis-hepatocellular carcinoma(HCC) role[J]. Chin Pharmacol Bull, 2018, 34(1): 44-50. doi:10.3969/j.issn.1001-1978.2018.01.011 |
| [7] |
王晓玲, 刘平, 崔云华, 等. 丹酚酸B抑制体外培养的原代大鼠肝星状细胞的增殖[J]. 中国中医基础医学杂志, 2007, 13(2): 126-7. Wang X L, Liu P, Cui Y H, et al. Salvianolic acid B inhibited the proliferation of primary rat hepatic stellate cells cultured in vitro[J]. J Basic Chin Med, 2007, 13(2): 126-7. doi:10.3969/j.issn.1006-3250.2007.02.017 |
| [8] |
卢明芹, 潘陈为, 李骥, 陈永平. 丹酚酸B对肝纤维化大鼠TGF-β1、MMP-2和TIMP-2表达的影响[J]. 世界华人消化杂志, 2007, 15(36): 3847-51. Lu M Q, Pan C W, Li J, Chen Y P. Effect of salvianolic acid B on expression of TGF- β1, MMP-2 and TIMP-2 in liver fibrosis rats[J]. World Chin J Digestol, 2007, 15(36): 3847-51. doi:10.3969/j.issn.1009-3079.2007.36.014 |
| [9] |
Tao Y Y, Wang Q L, Shen L, et al. Salvianolic acid B inhibits hepatic stellate cell activation through transforming growth factor beta-1 signal transduction pathway in vivo and in vitro[J]. Exp Bio Med(Maywood), 2013, 238(11): 1284-96. doi:10.1177/1535370213498979 |
| [10] |
Kumar M, Sarin S K. Is cirrhosis of the liver reversible[J]. lndian J Pediatr, 2007, 74(4): 393-9. doi:10.1007/s12098-007-0067-1 |
| [11] |
Lei X F, Fu W, Kim-Kaneyama J R, et al. Hic-5 deficiency attenuates theactivation of hepatic stellate cells and liver fibrosis through upregulation of Smad7 in mice[J]. J Hepatol, 2016, 64(1): 110-7. doi:10.1016/j.jhep.2015.08.026 |
| [12] |
卢晓晔, 钟雪云. Caspases与细胞凋亡(综述)[J]. 暨南大学学报(自然科学与医学版), 2000, 21(6): 121-4. Lu X Y, Zhong X Y. Caspases and apoptosis(review)[J]. J Jinan Univ(Natural SciMed Ed), 2000, 21(6): 121-4. |