2. 天津中医药大学天津市现代中药重点实验室-省部共建国家重点实验室培育基地，天津 301617
2. Tianjin State Key Laboratory of Modern Chinese Medicine-Province and Ministry Co-Established State Key Laboratory Cultivation Base, Tianjin University of Traditional Chinese Medicine, Tianjin 301617, China
随着环境的日益恶化以及大气层的不断破坏，辐射地球的紫外线(ultraviolet rays，UV)强度越来越大。皮肤长期暴露于紫外线下导致皮肤老化，大量实验研究表明，氧化应激是UV造成皮肤损伤的重要原因。当皮肤受到UV辐射时，皮肤内形成大量活性氧(reactive oxygen species，ROS)。正常情况下，体内ROS的产生和清除处于动态平衡，UV反复照射破坏了氧化和抗氧化防御系统平衡[1]。高水平的ROS等氧化物可引起表皮角质层和真皮层内细胞脂质、核酸、蛋白质等大分子损伤，影响相关信号通路传导。
转录因子NF-E2相关因子2(NF-E2-related factor 2，Nrf2)是调控细胞对抗外源性有害物质和氧化损伤的关键转录因子。Nrf2通过与抗氧化反应元件(antioxidant response element，ARE)相互作用，诱导抗氧化蛋白表达。Nrf2-ARE是机体抵抗内外界氧化损伤的防御性转导通路[2-3]。正常生理情况下，细胞质中的Nrf2与Keap1结合，并处于活性相对抑制状态。在应激状态下，Nrf2与Keap1解离转位至细胞核，启动下游超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)等基因和蛋白表达，从而维持机体氧化还原平衡。Nrf2-ARE通过抑制ROS，从而阻止光老化的形成。
黄芩(Scutellaria baicalensis Georgi)是唇形科黄芩属多年生草本植物，具有清热燥湿、泻火解毒、止血等功效。黄芩的活性成分主要是黄酮类，包括汉黄芩素、黄芩素、黄芩苷等。汉黄芩素、黄芩素、黄芩苷均具有抗氧化、抗衰老的作用[4]。植物雌激素通过调节雌激素受体，促进细胞中核转录因子Nrf2入核[5-9]，从而发挥抗氧化抗衰老作用[2, 10-12]。汉黄芩素、黄芩素、黄芩苷均为黄芩中植物雌激素类成分[12-13]，它们是否能通过雌激素受体调节Nrf2-ARE信号通路，发挥抗氧化作用还有待明确。本研究通过建立基于Nrf2-ARE通路的报告基因筛选模型，筛选黄芩中基于雌激素受体发挥抗氧化作用的活性成分，并利用UVB造模后的HaCaT细胞进行验证。
1 材料 1.1 仪器FORMA3111 CO2恒温培养箱(美国Thermo公司)；低温高速离心机(美国Beckman)；HZQ-C空气浴振荡器(哈尔滨市东明医疗仪器厂)；超净台(苏州佳宝净化工程有限公司)；SH2B型紫外光疗仪(美国Sigma)；DMIL倒置相差显微镜(德国LEICA)；Infinite M200型多功能酶标仪(瑞士Tecan)；VICTORTM X5多功能读板仪(Perkin Elmer)；Flex Station3多功能酶标仪(美国Molecula Device)。
1.2 药物与试剂叔丁基对苯二酚(tertiary butylhydroquinone，tBHQ，Sigma)；ICI 182780(Biotechne，批号：129453618)；全反式维甲酸ATRA(Solarbio，批号：1228A023)；ROS试剂盒、SOD测试盒(WST-8法)，均购自碧云天；SOD测试盒(WST-1法)，购自南京建成生物工程研究所；汉黄芩素(wogonin，批号：C19A8Q34235)、黄芩素(baicalein，批号：C20M8Y31962)、黄芩苷(baicalin，批号：P16S8F44143)，购自上海源叶生物科技有限公司。DMEM培养基(Gibco)；胎牛血清(Biological Industries)；DMSO(Sigma)；CCK-8试剂盒(日本Dojindo Lab)；感受态细胞DH5α、质粒小提试剂盒(天根)；萤火虫荧光素酶报告基因载体pGL4.37、海肾荧光素酶报告基因载体pRL-TK(Promega)；氨苄西林、LB液体培养基(干粉)、LB固体培养基(干粉)，购自Solarbio。
1.3 细胞株人肾上皮细胞系293T、人类永生化表皮细胞株HaCaT，来源为ATCC细胞库。
2 方法 2.1 质粒载体的转化与验证利用感受态细胞DH5α转化质粒pGL4.37，并加入到适量菌汤中，用无菌的涂布器取适量菌汤涂布于选择培养基上，倒置培养，37 ℃过夜。挑取单个菌粒，加入到含有适量肉汤的锥形瓶中，37 ℃、160 r·min-1过夜摇菌。从过夜摇菌的菌液中取1 mL于离心管中，做好标记。通过设计上游引物①：5′-GTGAATCGATAGTACTAACA-3′；上游引物②：5′-TCAACGAGTACGACTTCGTG-3′；下游引物①：5′-CCAAACTCATCAATGTATCT-3′三段引物，将质粒送华大基因公司测序，以进一步鉴定阳性克隆[5]。
2.2 质粒的提取及测定取“2.1”中阳性克隆的菌液，采用质粒小提试剂盒提取质粒。取1 μL质粒溶液，以DEPC水作空白对照。在紫外分光光度计上分别读取260 nm、280 nm波长下的吸光度值。
2.3 细胞培养复苏293T细胞，以10%胎牛血清的DMEM完全培养基，于37 ℃、5% CO2的培养箱中培养。
2.4 细胞活力实验使用CCK-8试剂盒考察不同浓度的汉黄芩素、黄芩素、黄芩苷对293T细胞活力的影响。取对数生长期的293T细胞，以3×104个/孔的密度接种于96孔细胞培养板中，贴壁生长达70%后，将1~100 μmol·L-1的汉黄芩素、黄芩素、黄芩苷，分别加入不同的细胞培养孔中，每孔100 μL，6个复孔，同时设置未加入药物的空白对照组。培养24 h后，吸弃细胞板中上清液，用PBS清洗2-3次，每孔加入100 μL PBS稀释的1×CCK-8工作液，37 ℃孵育1 h后，在酶标仪450 nm处测定吸光度(A值)。计算细胞存活率：细胞存活率(%)=
取对数生长期的293T细胞，以3×104个/孔的密度接种于96孔细胞培养板中，待细胞生长密度达到70%~80%时，使用PEI(1 g·L-1)转染试剂同时转染ARE荧光素酶报告质粒pGL4.37(每孔41 ng)和海肾荧光素酶报告质粒pRL-TK(每孔2.4 ng)，培养24 h。培养结束后，各孔分别加入Nrf2激活剂tBHQ(10 μmol·L-1)，不同浓度的黄芩苷、汉黄芩素、黄芩素和细胞基础培养基，培养6 h。弃上清液，D-Hank′s漂洗细胞，裂解后，用Dual-Luciferase检测系统检测。每组实验设6个复孔，重复3次。通过萤火虫荧光素酶活性与海肾荧光素酶活性对比，得到相对荧光素酶活性值。诱导表达倍数=(药物诱导的Luciferase/药物诱导的Renilla)/(基培对照组的Luciferase/基培对照组的Renilla)。
2.6 黄芩主要活性成分通过雌激素受体影响Nrf2-ARE通路发挥抗氧化作用预先给予浓度为1 μmol·L-1的雌激素受体抑制剂ICI 182780稀释液50 μL处理细胞1 h，再分别加入200 μmol·L-1的黄芩苷溶液50 μL，使黄芩苷最终浓度为100 μmol·L-1，继续培养6 h后，检测荧光，方法同“2.5”。
2.7 验证黄芩中主要活性成分的抗氧化作用 2.7.1 细胞模型的建立复苏HaCaT细胞，以10%胎牛血清的MEM完全培养基，于37 ℃、5% CO2的培养箱中培养，待细胞长到80%左右进行种板。抑制剂组预先给予浓度为1 μmol·L-1的雌激素受体抑制剂ICI 182780稀释液和1 μmol·L-1 Nrf2-ARE通路抑制剂ATRA[14]稀释液各50 μL处理HaCaT细胞1 h，再分别加入200 μmol·L-1的黄芩苷溶液50 μL，使黄芩苷最终浓度为100 μmol·L-1，给药组直接给予100 μmol·L-1的黄芩苷溶液100 μL，加入继续培养24 h后，造模。将预给药后的HaCaT细胞分别给予不同剂量的UV照射，设置空白对照组，24 h后分别收集细胞，检测细胞活性。光源采用美国Sigma公司的SH2B型紫外光疗仪，模拟UVB辐射皮肤损伤模型，光谱为280~320 nm，强度为60 mJ·cm-2。
2.7.2 UVB照射后HaCaT细胞ROS、SOD活性的检测使用ROS试剂盒考察空白组、模型组、给药组、抑制剂组的HaCaT细胞ROS活性。用无血清MEM培养基清洗细胞，每孔加入100 μL稀释好的DCFH-DA工作液，37 ℃、5% CO2细胞培养箱孵育30 min。用无血清MEM培养基洗涤细胞3次，每孔加入100 μL MEM培养基。在酶标仪中使用激发波长488 nm，发射波长525 nm检测荧光值。
使用SOD试剂盒考察空白组、模型组、给药组、抑制剂组的HaCaT细胞SOD活性。ICI 182780组采用WST-8检测法，ATRA组采用WST-1检测法。按说明书操作计算。
2.8 统计学处理采用SPSS 17.0统计分析软件进行数据处理，数据均以x±s表示，组间比较采用单因素方差分析。
3 结果 3.1 质粒载体转化的验证及质量的测定通过基因测序得2 098 bp，将该序列与已知质粒进行比对，同源性99%，其中测序序列结果中包含ARE序列，证明转化成功。质粒浓度为158.00 mg·L-1，纯度为1.97。
3.2 黄芩主要活性成分对293T细胞活力的影响如Fig 1所示，黄芩苷(1、10、100 μmol·L-1)组293T细胞活力与正常对照组相比差异无显著性，汉黄芩素和黄芩素1 μmol·L-1组293T细胞活力与正常对照组相比差异无显著性。1、10、100 μmol·L-1为黄芩苷对293T细胞的安全浓度，1 μmol·L-1为汉黄芩素和黄芩素的安全浓度。采用黄芩苷、汉黄芩素和黄芩素的安全浓度进行抗氧化活性的筛选。
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| Fig 1 Effect of scutellarin, baicalein, baicalinon cell viability of 293T cells(x±s, n=6) **P < 0.01 vs control |
分别将黄芩苷(1、10、100 μmol·L-1)，汉黄芩素(0.2、0.5、1 μmol·L-1)和黄芩素(0.2、0.5、1 μmol·L-1)加入转染了质粒DNA的293T细胞中，检测报告基因的活性。Fig 2结果显示，100 μmol·L-1黄芩苷可明显激活293T细胞中的Nrf2-ARE通路，诱导表达倍数为空白组的(1.56±0.01)倍(P＜0.01)；黄芩苷(1、10 μmol·L-1)诱导表达倍数与空白组比较差异均无显著性。如Fig 3所示，汉黄芩素和黄芩素0.2、0.5、1 μmol·L-1 3个浓度的诱导表达倍数均小于1，无抗氧化活性。
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| Fig 2 Effect of baicalin on luciferase inductionin 293T cells(x±s, n=6) **P < 0.01 vs control |
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| Fig 3 Effect of scutellarin, baicalein onluciferase induction in 293T cells(x±s, n=6) A:Control; B:tBHQ; C:0.2 μmol·L-1 of scutellarin; D: 0.5 μmol·L-1 of scutellarin; E: 1 μmol·L-1 of scutellarin; F: 0.2 μmol·L-1 of baicalein; G: 0.5 μmol·L-1 of baicalein; H: 1 μmol·L-1 of baicalein.**P < 0.01 vs control |
如Fig 4所示，预给予雌激素受体特异性抑制剂ICI 182780后，诱导表达倍数下降至(1.02±0.23)倍，抗氧化作用基本消失。
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| Fig 4 Effect of ICI 182780 on luciferase-upregulationby baicalin in 293T cells(x±s, n=6) **P < 0.01 vs control |
Tab 1结果显示，与模型组比较，黄芩苷(100 μmol·L-1)对HaCaT细胞有明显的抗氧化作用。预给予雌激素受体特异性抑制剂ICI 182780后，ROS值升高，SOD值下降，抗氧化作用消失。表明黄芩苷可能通过雌激素受体发挥抗氧化作用。
| Group | ROS(n=6) | SOD/units(n=3) |
| Control | 31.09±1.28** | 0.32±0.01** |
| Model | 44.81±1.02 | 0.12±0.03 |
| Baicalin | 36.80±0.89** | 0.22±0.03** |
| ICI 182780 | 43.35±1.65 | 0.08±0.06** |
| **P＜0.01 vs model | ||
Tab 2结果显示，与模型组比较，黄芩苷(100 μmol·L-1)对HaCaT细胞有明显的抗氧化作用。预给予Nrf2-ARE通路特异性抑制剂ATRA后，ROS值升高，SOD值下降，抗氧化作用消失。表明黄芩苷可能通过Nrf2-ARE通路发挥抗氧化作用。
| Group | ROS(n=6) | SOD/kU·L-1(n=3) |
| Control | 41.03±1.89** | 116.76±4.63* |
| Model | 49.56±1.42 | 58.56±9.46 |
| Baicalin | 41.56±1.18** | 109.34±42.65* |
| ATRA | 50.64±0.97 | 35.21±12.20 |
| *P＜0.05, **P＜0.01 vs model | ||
本研究采用基因载体pGL4.37-ARE与内对照报告基因载体pRL-TK共转染293T细胞，建立双荧光素酶报告基因系统，检测293T细胞中相关蛋白表达，并将其诱导表达倍数归一化，以消除实验中不同测试之间所固有的变化，从而筛选出可明显激活293T细胞中的Nrf2-ARE通路的活性成分黄芩苷，并为后续单体抗氧化成分的开发提供实验依据。
文献报道，黄芩苷可以下调Keap1表达、上调Nrf2蛋白水平，过量的Nrf2由胞质向核内转移，与ARE调控序列结合，启动下游SOD等基因和蛋白表达，从而清除氧自由基[10]，实现抗氧化作用[6]。研究表明，黄芩苷(100 μmol·L-1)可缓解UVB照射所致HaCaT细胞内ROS的过量表达，提高SOD活性，从而达到对UVB照射导致的氧化应激的保护作用。预加入雌激素受体抑制剂和Nrf2-ARE通路抑制剂抗氧化作用消失，从而推断黄芩苷可能是通过雌激素受体调节Nrf2-ARE通路发挥抗氧化作用。
黄芩素与黄芩苷化学结构相似，但在本研究构建的筛选模型中，在考察浓度范围内黄芩素未表现出抗氧化作用。刘靖丽等[15]从密度泛函理论角度探讨了黄芩素和黄芩苷抗氧化活性与结构关系，认为C6位的酚羟基是黄芩苷黄芩素的最大反应活性位点。在非极性溶剂中，抗氧化活性取决于脱氢能力，脱氢能力越强，抗氧化能力越强，黄芩苷的脱氢能力强于黄芩素，所以黄芩苷的抗氧化活性大于黄芩素；在极性溶剂中，抗氧化活性取决于电离势，电离势越低，抗氧化活性越强，黄芩苷的电离势低于黄芩素，所以黄芩苷的抗氧化活性强于黄芩素。与本研究结果一致。
本研究成功建立了双荧光素酶报告基因系统，用于体外筛选具有抗氧化活性成分，并用UVB造模后的HaCaT细胞进行了验证。结果发现，黄芩中主要活性成分黄芩苷通过雌激素受体影响Nrf2-ARE通路，发挥抗氧化作用。
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