2. 贵州医科大学省部共建药用植物功效 与利用国家重点实验室，贵州 贵阳 550014;
3. 贵州省中国科学院天然产物化学重点实验室，贵州 贵阳 550014
2. State Key Lab of Functions and Applications of Medicinal Plants, Guizhou Medical University, Guiyang 550014, China;
3. Key Lab of Chemistry for Natural Products, Guizhou Province and Chinese Academy of Science, Guiyang 550014, China
疼痛是诸多病征共有的症状，是动物的神经系统对伤害刺激的感觉。疼痛研究的焦点在于疼痛发生的机制以及干预治疗的策略和药物研究[1-2]。补体旁路激活会导致炎症和组织损伤[3]。有研究表明，补体与某些神经病理性疼痛关系密切[4-5]，但其与非神经性疼痛的关系尚不清楚。本研究用眼镜蛇毒因子(cobra venom factor，CVF)特异抑制补体旁路途径，观察小鼠对疼痛的反应。
1 材料与方法 1.1 实验动物与试剂SPF级KM小鼠，♀，体质量18~22 g，中国人民解放军第三军医大学动物实验中心提供，合格证：SCXK(军)2012-0011；普通新西兰兔，♂，2.5 kg，重庆腾鑫生物技术公司提供，合格证：SCXK(渝)2017-0010。CVF由本实验室制备，方法同文献[6]；其他试剂均为符合实验要求的国产或进口分析纯。
1.2 仪器MD-190酶标仪(美国MD公司)；5810R冷冻离心机(德国Eppendorf公司)；YLS-6B智能热板仪(山东省医学科学院设备站)；超低温冰箱(中科美菱科技股份有限公司)。
1.3 方法 1.3.1 CVF抑制小鼠血清补体旁路途径测定小鼠尾静脉注射0.05 μg·g-1 CVF，毛细管眼眶采取给药前和给药后1、3、6、12、24、48、72、120 h的血液，制备血清，参照文献[7]，测定并计算补体旁路溶血活性。
1.3.2 热板法热板仪55 ℃筛选合格小鼠32只，随机均分为4组：0.05 μg·g-1 CVF组和对照组、0.075 μg·g-1 CVF组和对照组，对照组给予等体积生理盐水。记录小鼠给药前和给药后1、3、6、12、24、48 h的痛觉反应时间，计算痛阈提高百分率：痛阈提高百分率=(药后痛觉反应时间-药前痛觉反应时间)/药前痛觉反应时间×100%。
1.3.3 醋酸扭体法32只小鼠随机均分为4组：0.05 μg·g-1 CVF组和对照组、0.075 μg·g-1 CVF组和对照组，对照组给予等体积生理盐水。在给药后1、6、12、24、48 h，腹腔注射0.6%醋酸0.1 mL，记录15 min内小鼠扭体次数，计算扭体反应抑制率：扭体反应抑制率=(对照组扭体次数-实验组扭体次数)/对照组扭体次数×100%。
1.3.4 数据处理数据采用x±s表示，用SPSS 19.0软件统计分析，组间检验采用t检验。
2 结果 2.1 CVF抑制补体旁路途径的作用静脉注射CVF后，小鼠补体旁路溶血活性快速下降。给药1 h时，补体活性降至(7.34±1.74)%，3、6 h时降至(5.89±2.28)%、(5.6±2.13)%，72 h时已回升至(34.85±7.78)%，120 h已基本恢复至(88.56±16.57)%。
2.2 CVF抑制小鼠热疼痛反应的作用CVF能明显抑制小鼠对热疼痛的反应。与给药前相比，0.05 μg·g-1 CVF组在给药后3 h的痛觉反应时间明显延缓(P＜0.05)；0.075 μg·g-1 CVF组在给药后1、3、6、12 h的痛觉反应时间均明显延缓(P＜0.01)。与对照组相比，0.05 μg·g-1 CVF组在给药后3、6 h的痛阈百分率明显提高(P＜0.01)；0.075 μg·g-1 CVF组在给药后1、3、6、12 h的痛觉反应时间明显延缓(P＜0.01)，其痛阈百分率明显提高(P＜0.01)。见Tab 1。
| Group | Dose /μg·g-1 |
Time/h | ||||||
| 0 | 1 | 3 | 6 | 12 | 24 | 48 | ||
| Control | 0 | 9.26±1.59 | 7.29±2.53 | 9.04±1.18 | 6.87±0.46 | 8.03±0.89 | 9.09±1.99 | 7.33±1.27 |
| CVF | 0.05 | 7.37±0.94 | 6.74±1.33 | 9.16±1.96# | 8.69±1.53 | 6.99±1.51 | 6.23±1.93 | 6.21±0.78 |
| Control | 0 | 7.52±1.01 | 6.65±1.28 | 6.65±1.33 | 6.53±0.62 | 6.82±0.84 | 7.84±1.33 | 5.97±0.68 |
| CVF | 0.075 | 7.63±1.46 | 12.70±2.77**## | 11.26±3.23**## | 11.06±2.91**## | 10.57±2.42**## | 8.35±1.98 | 6.03±2.04 |
| **P < 0.01 vs control; #P < 0.05, ##P < 0.01 vs 0 h | ||||||||
CVF能有效抑制醋酸造成的小鼠扭体反应。Tab 2结果显示，与对照组比较，0.05、0.075 μg·g-1 CVF组小鼠均在给药后1、6 h的扭体次数明显减少(P＜0.01)；扭体抑制率在1 h时分别为(63.19±9.28)%、(64.65±17.83)%，6 h时分别为(61.11±19.43)%、(49.82±15.99)%，12 h时分别为(2.9±26.31)%、(20.86±39.43)%，24 h时分别为(18.66±55.92)%、(22.73±22.96)%，48 h时分别为(0.48±42.15)%、(12.12±14.7)%。
| Group | Dose /μg·g-1 |
Time/h | ||||
| 1 | 6 | 12 | 24 | 48 | ||
| Control | 0 | 40.75±10.26 | 47.25±7.23 | 31.63±17.52 | 22.13±19.70 | 26.25±16.11 |
| CVF | 0.05 | 15.00±3.78** | 18.38±9.18** | 32.00±8.52 | 18.00±12.38 | 26.13±11.06 |
| Control | 0 | 39.25±5.01 | 33.38±7.63 | 35.38±8.19 | 33.00±7.73 | 36.13±6.77 |
| CVF | 0.075 | 13.88±7.00** | 16.75±5.34** | 28.00±13.95 | 25.50±7.58 | 31.75±5.31 |
| **P < 0.01 vs control | ||||||
本研究表明，尾静脉注射CVF抑制小鼠体内补体旁路途径后，能明显减轻小鼠对热疼痛和醋酸刺激的反应，且这种抑制作用表现出一定的量效关系；小鼠对疼痛的反应与CVF致小鼠血清中补体旁路的变化有较好的对应性。热板法是一种筛选中枢性镇痛药的经典方法，醋酸扭体法适用于中枢和外周镇痛药的筛选。因此，上述结果提示，血清补体旁路与小鼠疼痛反应，尤其是中枢性疼痛可能有密切关联，这为进一步研究补体与疼痛的关系及潜在的药物靶点提供了参考。
| [1] |
Raney B E, Thankam G F, Dilisio F M, et al. Pain and the pathogenesis of biceps tendinopathy[J]. Am J Transl Res, 2017, 9(6): 2668-83. |
| [2] |
Colloca L, Ludman T, Baron R, et al. Neuropathic pain[J]. Nat Rev Dis Primers, 2017, 3: 17002. doi:10.1038/nrdp.2017.2 |
| [3] |
Ricklin D, Reis E S, Lambris D. Complement in disease: a defence system turning offensive[J]. Nat Rev Nephrol, 2016, 12(7): 383-401. doi:10.1038/nrneph.2016.70 |
| [4] |
Nie F C, Wang J B, Su D, et al. Abnormal activation of complement C3 in the spinal dorsal horn is closely associated with progression of neuropathic pain[J]. Int J Mol Med, 2013, 31(6): 1333-42. doi:10.3892/ijmm.2013.1344 |
| [5] |
Levin M E, Jin J G, Ji R R, et al. Complement activation in the peripheral nervous system following the spinal nerve ligation model of neuropathic pain[J]. Pain, 2008, 137(1): 182-201. doi:10.1016/j.pain.2007.11.005 |
| [6] |
朱芳娟, 李敏, 杨铭, 等. 槲皮素及其衍生物对补体旁路激活致内皮细胞炎症反应的干预作用[J]. 中国药理学通报, 2018, 34(11): 1539-43. Zhu F J, Li M, Yang M, et al. Effect of quercetin and its derivatives on inflammatory response of endothelial cells induced by activation of complement alternative pathway[J]. Chin Pharmacol Bull, 2018, 34(11): 1539-43. doi:10.3969/j.issn.1001-1978.2018.11.013 |
| [7] |
孙黔云, 叶巧玲, 闫银萍. 小鼠血清补体替代途径溶血活性测定的新方法[J]. 中国药理学通报, 2011, 27(11): 1619-22. Sun Q Y, Ye Q L, Yan Y P. A new method for measurement of the alternative pathway activity of mouse serum complement[J]. Chin Pharmacol Bull, 2011, 27(11): 1619-22. doi:10.3969/j.issn.1001-1978.2011.11.034 |