2. 南昌大学基础医学院 江西 南昌 330006
2. Basic Medical College, Nanchang University, Nanchang 330006, China
人类免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus，HIV)感染并发外周神经病理损伤时，表现为肢体远端感觉神经病变[1-2]，主要症状为周围神经病理性疼痛，影响约60% HIV感染患者，随着病程延长，极度疼痛频现，严重者可丧失行走功能[3]。其发病率高、机制复杂、治疗困难，常规镇痛药副作用大[4]。因此，寻求安全高效药物，阐明其作用靶点，减轻HIV感染患者神经病理痛迫在眉睫。
HIV感染导致周围神经病变时，背根神经节(dorsal root ganglia, DRG)神经元和传入神经纤维均受损。DRG可将外周神经末梢感受的伤害性刺激信号传递到中枢神经系统[4]。HIV病毒包膜糖蛋白gp120可诱发周围神经的机械痛敏和热痛敏，研究表明，嘌呤2X受体可辅助gp120进入巨噬细胞，gp120与巨噬细胞的相互作用，最终导致神经病理痛的发生[5]。作者前期研究发现[6]，表达在DRG神经元的嘌呤2X3受体(P2X3R)通过激活ERK信号通路，介导HIV gp120诱发的周围神经病理痛，应用P2X3R拮抗剂可明显减轻模型大鼠痛行为。中药单体蛇床子素(osthole，Ost)是传统中药蛇床子的主要有效成分之一，具有抗炎、抗病原微生物、神经保护等多种药理活性[7-8]。本研究通过建立gp120浸浴坐骨神经大鼠模型，观察Ost处理后，模型大鼠痛行为及大鼠DRG中P2X3R表达变化及作用机制，为治疗HIV gp120诱发周围神经病理痛，寻求毒副作用小、适合长期用药的天然药物提供实验基础。
1 材料与方法 1.1 材料 1.1.1 实验动物与细胞健康成年SD大鼠，♂，体质量(210±20)g，由南昌大学医学部实验动物科学部提供，动物使用许可证号：SYXK(赣)2015-0001。HEK293细胞购自中国科学院上海细胞库。
1.1.2 试剂Ost(美国Selleck Chemicals公司)；ATP、gp120(美国Sigma Aldrich)；P2X3R引物(上海生工生物)；抗β-actin抗体、P2X3R抗体(以色列Alomone Lab)；ERK、p-ERK抗体(美国CST)；肿瘤坏死因子α受体(tumor necrosis factor α receptor, TNF-αR)抗体(美国Abcam)；人pcDNA3.0-EGFP-P2X3R质粒由上海诺百生物公司构建，EGFP与P2X3R融合。
1.1.3 仪器BME-403 Von Frey机械刺激仪、BME-410C型热痛刺激仪(中科院生物医学工程研究所)；全细胞膜片钳系统(美国Axon200B)；7500型qPCR仪(ABI公司)；倒置荧光显微镜(日本Olympus)。
1.2 方法 1.2.1 神经病理痛大鼠模型的构建大鼠适应性饲养1周，随机分4组(每组8只)：假手术组(sham)、假手术加Ost处理组(sham+Ost)、gp120坐骨神经浸浴处理模型组(gp120)、gp120模型并给予Ost作用组(gp120+Ost)。gp120神经病理痛大鼠建模：100 g·L-1水合氯醛麻醉(3 mL·kg-1，腹腔注射)大鼠，无菌条件下，取大鼠左大腿后外侧切口，钝性分离坐骨神经，用250 μL HIV gp120(用含大鼠血清白蛋白浓度为1 mL·L-1的生理盐水溶解200 ng gp120)浸透的外科可吸收性无菌明胶海绵(祥恩，2 mm× 6 mm)，疏松包裹在坐骨神经的三支分叉近端，缝合肌肉与皮肤。Sham组大鼠所用明胶海绵浸泡液不含gp120，其余同模型组。Sham+Ost组及gp120+Ost组大鼠于术前7 d及整个建模期灌胃给予Ost (40 mg·kg-1·d-1)。术后d 14将4组大鼠迅速断头，取左侧L4~L6 DRG备用。
1.2.2 大鼠痛行为检测建模术前(0 d)及术后d 1、3、5、7、9、11、14测定各组大鼠机械痛缩足反射阈值(paw withdrawal threshold, PWT)与热痛缩足反射潜伏期(paw withdrawal latency, PWL)。每次测量的时间和其它条件均保持一致。
1.2.2.1 PWT检测BME-404电子机械刺激仪，测试针尖端接触面直径0.6 mm，测痛范围0~50 g，分辨率0.05 g。大鼠置于铁丝网架上的透明有机玻璃盒中(20 cm×10 cm×30 cm)适应0.5 h，用测试针刺激大鼠左足底，从小力度开始，直到某个力度刺激大鼠引起缩足反应，电脑软件自动记录此次压力值，为有效阈值，相邻两次测量的间隔时间至少为3 min，刺激引起的反应(如舔足、甩腿等)完全消失后才进行下次测量。一共记录3次，3次的平均值即为PWT。
1.2.2.2 PWL检测采用BME-410C型全自动热痛刺激仪。将与上述相同的玻璃盒与大鼠放在3 mm厚的玻璃板上，热辐射灯照射大鼠左足底，记录从照射到出现抬腿的时间，一共测量3次，取3次均值作为PWL。每次切断时间为30 s，且间隔3 min以上，以防组织损伤。
1.2.3 实时荧光定量PCR(qPCR) 检测提取大鼠DRG总RNA，逆转录后进行qPCR反应。P2X3R上游引物：5′-CCAACAGAGTCATGGACAGT-3′，下游引物：5′-GGACAGAATCCTTGCATTTGA-3′；β-actin上游引物：5′-TGTCACCAACTGGGACGATA-3′，下游引物：5′-GGGGTGTTGAAGGTCTCAAA-3′。用2-ΔΔCT法计算P2X3受体mRNA相对表达量。
1.2.4 蛋白印迹检测将DRG置于加有200 μL组织裂解液(含PMSF)的1 mL匀浆器中，冰上反复研磨裂解后，置1.5 mL EP管，4 ℃、12 000×g离心10 min，取上清，加入6×loading buffer和DTT，混匀后煮沸5 min，-20 ℃保存备用。制备10%的SDS-PAGE凝胶，蛋白上样、电泳、转膜、封闭、洗膜，一抗4 ℃孵育过夜。次日洗膜后，二抗孵育1 h，ECL发光试剂盒显影，以β-actin为内参，Image-Pro Plus软件分析条带灰度值。
1.2.5 免疫组织化学检测PBS清洗DRG，4%多聚甲醛固定48 h后，梯度乙醇脱水、二甲苯透明、浸蜡、石蜡包埋、切片(厚5 μm)，37 ℃烘干2 h后，室温保存备用。实验时，切片60 ℃烘烤30 min脱蜡，Triton X-100作用15 min，H2O2作用5 min，5%山羊血清封闭1 h，P2X3R一抗4 ℃孵育过夜，辣根酶标记链霉卵白素工作液室温孵育30 min，DAB显色2 min，PBS终止显色反应，梯度乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封片，倒置显微镜下拍片。Image-Pro Plus软件分析每组(n=8)切片中神经元染色光密度值，每张切片选取一个有代表性的视野，统计各组切片中P2X3受体阳性反应差异。
1.2.6 HEK293细胞培养与P2X3受体质粒转染常规复苏HEK293细胞，在37 ℃含有5% CO2的细胞培养箱中培养，传代，均匀接种在35 mm培养皿中，使细胞密度为1×105个/cm2，继续培养至细胞达到80%~90%汇合度，瞬时转染人pcDNA3.0-EGFP-P2X3R质粒(Lipofectamine 2000，Invitrogen)，孵育6 h。以Opti-MEM洗涤细胞，并孵育24~48 h。倒置荧光显微镜下观察各皿细胞GFP荧光显色情况，每皿细胞寻找3个具有代表性的视野，观察100个细胞，计算阳性细胞百分比。转染后1~2 d进行全细胞膜片钳记录。
1.2.7 全细胞膜片钳记录实验荧光倒置显微镜下实施全细胞膜片钳技术，记录全细胞电流。两步法拉制微电极，电极液充灌微电极，微电极填充液由(以mmol·L-1计)K葡萄糖酸盐145、EGTA 0.75、HEPES 10、CaCl2 0.1、MgATP 2、Na3GTP 0.3组成的内部溶液。用含有(以mmol·L-1计)NaCl 126、KCl 2.5、葡萄糖10、MgCl2 1.2、CaCl2 2.4、NaHCO3 18的细胞外溶液连续灌注。操纵微电极尖端接近细胞表面，微电极内施加负压，形成高阻封接(1~10 GΩ)，钳制电压于-60 mV，吸破细胞膜。药物浓度为ATP 100 μmol·L-1、Ost 100 μmol·L-1，药物灌流管直径0.2 mm，管口距记录细胞约100 μm。给药时间2 s，洗脱时间4 min。数据以2 Hz低通滤波，以5 kHz数字化，并使用Axopatch 200B膜片钳放大器、Digidata 1440A接口和pClamp10.3软件(Axon仪器)存储在实验室计算机中。SigmaPlot软件绘制细胞电流变化图。
1.2.8 统计学方法实验数据以x±s表示，用GraphPad Prism 5、SigmaPlot软件及SPSS 21.0统计软件对数据进行统计分析，两组之间比较用非配对t检验，方差分析用于多组间差异比较。
2 结果 2.1 Ost抑制gp120模型大鼠DRG中P2X3受体的表达上调如Fig 1所示，gp120模型组DRG中P2X3R mRNA及蛋白表达水平较sham组明显增加(P < 0.01)，gp120+Ost组P2X3R mRNA及蛋白表达水平较gp120模型组降低(P < 0.01)；sham与sham+Ost组之间无差异(P>0.05)。
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| Fig 1 Effects of osthole treatment on expression of P2X3R mRNA (A) and protein (B) in L4~L6 DRGs from each group (x±s, n=6) **P < 0.01 vs sham group; ##P < 0.01 vs gp120 group |
如Fig 2所示，造模前各组间PWT及PWL的基础值差异无显著性(P>0.05)。术后d 3开始，gp120模型大鼠PWT及PWL相比sham组日趋降低(P < 0.05或P < 0.01)；gp120+Ost组大鼠PWT及PWL较gp120模型组增加(P < 0.05, P < 0.01)。
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| Fig 2 Osthole relieved mechanical(A) and thermal hyperalgesia(B) in gp120 treated rats (x±s, n=8) *P < 0.05, **P < 0.01 vs sham group; #P < 0.05, ##P < 0.01 vs gp120 treated group |
免疫组织化学染色对各组大鼠L4~L6 DRG P2X3受体进行形态学检测，Fig 3结果显示，P2X3受体表达在神经元上，且gp120组P2X3受体表达较sham组升高(P < 0.01)，gp120+Ost组P2X3受体表达较gp120组降低(P < 0.01)；sham组与sham+Ost组比较差异无显著性(P>0.05)。
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| Fig 3 Effects of osthole on expression of P2X3 receptor immunoreactivity in L4~L6 DRGs (x±s, n=6) Arrows indicate P2X3 receptor positive neurons. **P < 0.01 vs sham group; ##P < 0.01 vs gp120 treated group. |
Fig 4的蛋白印迹结果显示，gp120模型组大鼠DRG中TNF-αR表达水平较假手术组明显增加(P < 0.01)；gp120+Ost组TNF-αR表达水平较gp120模型组降低(P < 0.01)；sham组与sham+Ost组TNF-αR表达水平差异无显著性(P>0.05)。
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| Fig 4 Osthole decreased expression of TNF-αR protein in DRG of gp120 treated rats (x±s, n=6) **P < 0.01 vs sham group; ##P < 0.01 vs gp120 group |
如Fig 5所示，各组大鼠DRG中ERK1/2的蛋白表达水平无明显差异；p-ERK1/2的表达水平，gp120模型组较sham组明显增加(P < 0.01)，gp120+Ost组较gp120模型组降低(P < 0.01)；sham与sham+Ost组无差异。
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| Fig 5 Effects of osthole on expression of ERK1/2 and p-ERK1/2 in L4~L6 DRGs (x±s, n=6) **P < 0.01 vs sham group; ##P < 0.01 vs gp120 group |
Fig 6的全细胞膜片钳记录实验显示，Ost降低转染pcDNA3.0-EGFP-P2X3R质粒的HEK293细胞ATP的激动电流。
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| Fig 6 Effects of osthole on ATP-activated current in HEK293 cells transfected with hP2X3 receptor A: Current traces in the upper row demonstrated that ATP-activated currents were time dependent with or without osthole; B: Relative current activated by ATP when pre-exposure osthole at different time points. *P < 0.05, **P < 0.01 vs 0 s; C: Current density between osthole+ATP treatment and ATP treatment alone. Bar graphs show the normalized, mean peak current (x±s, n=12). *P < 0.05 vs ATP alone. |
已有研究表明，周围神经应用gp120后可产生机械痛觉过敏行为[9]，提示gp120可能是HIV感染引发神经病理痛的重要因素[4]。本研究结果显示，用gp120浸浴的海绵作用于坐骨神经后，大鼠的机械痛敏、热痛敏与假手术组比较逐渐增强。同时，gp120模型大鼠DRG蛋白印迹实验、免疫组织化学与qPCR实验发现，P2X3受体蛋白与mRNA表达较假手术组明显升高，说明P2X3受体上调与gp120诱发的痛行为有关。Ost处理后，gp120模型大鼠DRG中P2X3受体蛋白与mRNA表达均较未处理的gp120模型大鼠降低，且Ost处理后大鼠机械痛敏与热痛敏减弱。研究结果提示，Ost可降低P2X3受体表达而影响大鼠机械痛敏与热痛敏行为。
ATP作为受损细胞和感觉神经末梢释放的递质[10]，可激活神经元上的P2X3受体[11]，增加神经元的异常兴奋，导致神经病理痛。HIV gp120可直接或间接刺激神经系统释放促炎性细胞因子，如TNF-α等[4, 12-13]，它们可激活神经元上的TNF-α受体，从而增加神经元的兴奋性，导致炎性反应加重。本研究结果显示，gp120模型大鼠DRG中TNF-α受体表达较假手术组增加，说明gp120处理可诱发神经系统炎症，诱发模型大鼠出现神经病理痛行为。gp120+Ost组大鼠DRG中TNF-α受体表达较gp120模型大鼠降低，提示Ost可能通过其抗炎作用，减轻gp120诱发的机械痛敏与热痛敏。
ATP是神经系统重要递质。HEK293细胞无功能性受体表达，常作为转染相关受体进行功能研究的工具。本研究发现，Ost可降低转染pcDNA3.0-EGFP-P2X3R质粒的HEK293细胞ATP激动电流，提示Ost通过阻断P2X3受体的激活，抑制神经元的异常放电，从而减轻机械痛敏和热痛敏。免疫组织化学实验结果表明，P2X3受体主要表达在DRG神经元上，提示Ost可影响gp120对神经元的病理性作用，从而影响gp120引发的P2X3受体激活。
ERK的磷酸化代表其信号通路的激活，参与初级传入神经受损引起的疼痛信号传递[14]。因此，阻断初级感觉神经元中ERK的活性可减轻机械痛敏和热痛敏。研究表明，P2X3受体激活之后，ERK1/2介导的信号转导通路也被激活，进而发生疼痛[14-15]。本研究结果中，HIV gp120模型大鼠DRG中p-ERK1/2与ERK1/2蛋白条带光密度比值较假手术组更高，说明DRG中ERK1/2的磷酸化与P2X3受体介导的gp120引发的神经病理痛有关。Ost处理后，模型大鼠DRG中p-ERK1/2与ERK1/2蛋白表达较gp120模型大鼠明显降低，结果提示Ost下调P2X3受体表达，进而抑制ERK1/2的磷酸化，使机械痛敏与热痛敏减轻。
总之，HIV gp120作用于周围神经可导致DRG中P2X3受体表达升高，gp120处理增加促炎性因子的释放，上调的P2X3受体及促炎因子作用可导致DRG神经元敏化，造成gp120诱发的神经病理痛。Ost通过降低gp120引起的DRG中P2X3受体表达上调，通过减少促炎因子TNF-α的释放而减少TNF-αR的激活，抑制ERK1/2的磷酸化，阻断疼痛信号传递通路，减轻gp120引起的机械痛敏与热痛敏。
( 致谢: 本研究在江西省高等学校基础医学重点实验室、南昌大学基础医学研究所及南昌大学基础医学院生理学实验室完成，感谢支持！)
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