2. 上海交通大学医学院附属国际和平妇幼保健院麻醉科，上海 200030;
3. 上海交通大学电子信息与电气工程学院，上海 200240;
4. 安徽医科大学药学院，安徽 合肥 230032
2. Dept of Anesthesiology, International Peace Maternity & Child Health Hospital of China, Shanghai 200030, China;
3. School of Electronic Information and Electrical Engineering, Shanghai Jiao Tong University, Shanghai 200240, China;
4. School of Pharmacy, Anhui Medical University, Hefei 230032, China
铁死亡(ferroptosis)是在2012年Cell杂志上最先被提出，有别于传统死亡方式的一种新型的死亡形式的概念，它是一种以铁和活性氧簇(reactive oxygen species, ROS)依赖为特征的细胞调节性坏死。在细胞的形态、生化指标、基因水平方面，与其他的调节性坏死有明显的区别[1]。近年来研究发现，铁死亡发生可能在许多神经退行性疾病，如阿尔茨海默病、帕金森综合征、脑缺血性中风的发生、发展中起重要作用[2]。
氧化应激和众多神经退行性疾病有着重要的联系，谷氨酸盐(glutamate, Glu)引起的氧化应激是神经退行性疾病的一种重要的诱因。Glu损伤模型是研究氧化应激引起的神经细胞死亡的一种常用模型。使用高浓度的Glu孵育神经细胞来抑制胱氨酸/谷氨酸反向转运系统xCT(cystine/glutamate antiporter或system Xc-, xCT或SLC7A11)，从而抑制胱氨酸的摄入，引起细胞内谷胱甘肽(glutathione, GSH)剥夺和ROS积聚[3]。虽然Glu引起神经细胞死亡主要是由GSH剥夺引起的细胞内ROS积聚引起，但并不是唯一机制。有研究表明，caspase依赖的凋亡途径参与12-脂氧合酶(12-lipoxygenase，12-LOX)的激活，凋亡诱导因子(apoptosis-inducing factor，AIF)的转位与Glu引起的神经毒性有关[4-5]。近年来，在海马切片培养组织进行抑制铁死亡的实验中，发现抑制铁死亡可以抑制Glu引起的神经细胞死亡[1]。
p53属于p53家族，主要作用是调控细胞周期，诱导细胞凋亡和DNA损伤，是一种在多种癌症中均发生明显改变的重要抑癌基因。除了肿瘤抑制作用外，p53还在神经退行性疾病、机体的衰老中发挥重要作用[6]。有研究显示，p53可以通过调节xCT的表达，增加肿瘤细胞对铁死亡的敏感性，从而发挥抑癌作用[7]，但在神经系统中，其对铁死亡的影响尚不清楚。因此，本研究使用p53特异性激活剂Tenovin-1, 在HT22细胞中诱导高p53状态，使用Glu损伤模型模拟神经退行性疾病中氧化应激损伤，探讨铁死亡是否参与p53抵抗HT22细胞Glu损伤及其机制。
1.1 材料 1.1.1 细胞与试剂小鼠海马神经元细胞系HT22细胞，上海交通大学金卫林老师实验室馈赠。胎牛血清，购自南美Lonsera公司；DMEM/F-12细胞培养液，购自美国HyClone公司；0.25%胰酶消化液，购自Gibco公司；谷氨酸粉(批号09581)、Hoechst 33342活细胞染料剂(批号B2261)，购自美国Sigma公司；p53特异性激活剂Tenovin-1(批号：S8000)、铁死亡特异性诱导剂Erastin(批号：S7242)，购自美国Selleck公司；p53抗体(批号：10442-1-AP)，购自武汉三鹰；4-羟基壬烯醛(4-hydroxynonenal, 4-HNE)(批号：ab46545)、xCT(批号：ab175186)抗体，购自英国Abcam公司；β-actin、GAPDH抗体，购自美国Santa Cruz公司；FITC标记山羊抗兔抗体，购自北京中杉金桥生物技术有限公司；DHE荧光探针、细胞增殖检验试剂盒(cell counting kit-8，CCK-8)，购自碧云天生物技术研究所；ECL发光试剂盒、BODIPYTM 581/591 C11脂质氧化探针，购自美国Thermo Fisher公司；FeRhoNoxTM-1铁离子探针，购自日本Goryochemical公司。
1.1.2 仪器荧光显微镜(德国Leica公司); 细胞培养箱(美国Thermo公司)；酶标仪(德国Tecan公司)；离心机(德国Beckman公司)；蛋白电泳仪、Bioshine ChemiQ化学发光成像系统(美国Bio-Rad公司)。
1.2 方法 1.2.1 细胞分组HT22细胞随机分为6组：①对照组(CON组)：HT22细胞置于DMEM/F12完全培养基中常规培养；② p53高表达组(p53-H组)：使用终浓度1 μmol·L-1 Tenovin-1预处理HT22细胞6 h，使HT22细胞处于高p53状态；③谷氨酸处理组(Glu组)：使用终浓度5 mmol·L-1的Glu处理HT22细胞；④ Erastin处理组(Era组)：使用终浓度0.5 μmol·L-1的Erastin处理HT22细胞；⑤ p53高表达后谷氨酸处理组(Glu-p53组)：使用终浓度1 μmol·L-1的Tenovin-1预处理HT22细胞6 h后，使用终浓度5 mmol·L-1 Glu处理；⑥ p53高表达后Erastin处理组(Era-p53组)：使用终浓度1 μmol·L-1的Tenovin-1预处理HT22细胞6 h后，使用终浓度0.5 μmol·L-1的Erastin处理HT22细胞。
1.2.2 HT22细胞活力的检测采用CCK-8法检测。取对数生长期的HT22细胞，以1×104个/孔接种于96孔板，培养12 h后，加入不同浓度Glu(终浓度为1、5、10 mmol·L-1)和Erastin(0.25、0.5、1 μmol·L-1)，另设对照组(CON)和空白孔(相应量细胞培养液和CCK-8溶液)，每孔设5个复孔。置于孵育箱培养6 h后，每孔加入10 μL CCK-8溶液(每孔培养基100 μL)，置于孵育箱孵育2 h后，在酶标仪450 nm波长处测定各孔吸光度值(A), 计算各实验孔相对存活率。相对存活率=(A实验组-A空白组)/(A对照组-A空白组)，实验重复3次。
1.2.3 PI/Hoechst荧光双标染色法检测HT22细胞高p53状态对Glu损伤和Erastin诱导的铁死亡的保护作用以5×104个/孔接种于24孔板的HT22细胞，按照“1.2.1”方法分组处理。处理8 h后，将终浓度为5 mg·L-1 Hoechst 33342和PI溶液加入完全培养基，避光，37 ℃、5% CO2孵育10 min，置于荧光显微镜下观察拍照，计算相对细胞存活率。相对细胞存活率以大于500个细胞数的Hoechst+与(Hoechst++PI+)的比值来表示。实验重复3次。
1.2.4 Western blot检测p53和xCT蛋白表达差异① p53蛋白表达水平的检测：HT22细胞以1×105个/孔接种于6孔板，培养12 h后，加入不同浓度的Tenovin-1(0.1、1、10 μmol·L-1)处理6 h后，制取样品，经PBS冲洗2遍，加入含有蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂的细胞裂解液，冰上裂解10 min，使用细胞刷刮下细胞，置于1.5 mL EP管中，超声3次，每次5 s。用BCA蛋白定量试剂盒检测蛋白浓度。将蛋白样品与3×SDS上样缓冲液按2 : 1体积混合，100 ℃煮沸5 min变性，迅速置于冰上使温度降至室温后，13 000×g离心5 min。以每孔35 μg蛋白样品量进行蛋白电泳后，使用200 mA恒流1 h，将蛋白转至PVDF膜上，使用5%脱脂奶粉室温封闭1 h。TBST洗涤3遍，每次5 min。p53、β-actin抗体按1 : 1 000稀释，室温放置1 h，4 ℃过夜后，TBS洗涤3遍，每次10 min。加入1: 5 000稀释的二抗室温孵育1 h，使用ECL发光试剂盒显影，以β-actin作为内参。② xCT蛋白表达水平检测：HT22细胞以1×105个/孔接种于6孔板，培养12 h后，按“1.2.1”方法进行分组处理，处理8 h后，按如上方法制备样品，使用Western blot检测xCT蛋白表达水平。xCT、GAPDH抗体按1 : 1 000稀释。
1.2.5 免疫荧光检测脂质氧化产物4-HNE生成以5×104个/孔接种于24孔板细胞爬片的HT22细胞，按照“1.2.1”方法，选取Glu处理组(①、②、③、⑤组)进行处理，处理8 h后，用PBS洗涤2遍，使用4%的多聚甲醛置于室温固定15 min，将细胞用PBS冲洗3遍，使用15%的驴血清室温封闭1 h，细胞使用PBS清洗3遍后，加入一抗(4-HNE，稀释比例为1 : 200)，室温孵育1 h后4 ℃过夜。d 2，PBS洗涤3遍，加入二抗(稀释比例为1: 400)，室温孵育1 h，PBS洗涤3遍，使用含有10 mg·L-1 DAPI-甘油封片剂封片后，荧光显微镜下观察，比较不同组的平均荧光强度。
1.2.6 BODIPY 581/591 C11脂质氧化荧光探针检测细胞内脂质氧化以5×104个/孔接种于24孔板的HT22细胞，按照“1.2.1”方法选取Glu损伤组(①、②、③、⑤组)处理8 h。甲醇溶解BODIPY 581/591 C11荧光探针至浓度为10 mmol·L-1的贮存液，将终浓度为1 μmol·L-1 BODIPY 581/591 C11荧光探针加入处理完成的细胞，置于37 ℃孵育箱孵育30 min后，使用PBS冲洗2遍，清除未结合的染料，荧光显微镜观察荧光效果，比较不同组的平均荧光强度。
1.2.7 FeRhoNoxTM-1荧光探针检测细胞内Fe2+变化以5×104个/孔接种于24孔板的HT22细胞，按照“1.2.1”方法选取Glu损伤组(①、②、③、⑤组)处理8 h。使用DMSO将FeRhoNoxTM-1荧光探针溶解为1 mmol·L-1的储存液。于24孔板处理完成的细胞，使用PBS冲洗2遍后，用HBSS溶液稀释FeRhoNoxTM-1储存液至5 μmol·L-1工作液，每孔加入200 μL工作液，于37 ℃、5% CO2孵育箱孵育1 h后，用HBSS溶液冲洗2遍，置于荧光显微镜下观察，计算各组平均荧光强度。
1.2.8 统计学分析采用SPSS 20.0软件进行数据分析，计量资料以x±s表示，组间比较采用单因素方差分析(ANOVA)，两两比较采用Tukey检验。
2.1 Tenovin-1引起HT22细胞p53蛋白水平上升Tenovin-1(0.1、1、10 μmol·L-1)浓度依赖性引起HT22细胞p53蛋白水平上升，按照产品介绍，Tenovin-1作用后6 h即可引起HT22细胞内p53水平上升，故选择Tenovin-1预处理6 h。如Fig 1所示，相较于对照组，当1 μmol·L-1 Tenovin-1作用于HT22细胞6 h后，p53蛋白水平明显上升(P＜0.05)。因此，选取1 μmo·L-1 Tenovin-1作为后续实验诱导p53高表达的最适浓度。
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| Fig 1 Increased p53 protein levels induced by Tenovin-1 in HT22 cells (x±s, n=3) *P < 00.05 vs control |
Glu(1、5、10 mmol·L-1)浓度依赖性地抑制HT22细胞的活力，当Glu浓度为5 mmol·L-1时，HT22细胞存活率约为40%(P＜0.01)，故选择5 mmol·L-1作为后续实验的合适损伤浓度。如Fig 2A所示，使用1 μmol·L-1 Tenovin-1预处理6 h引起HT22细胞p53高表达后，可明显抑制Glu引起的细胞死亡(P＜0.01)。为了确定p53是否可以抵抗铁死亡，另外使用了经典的铁死亡诱导剂Erastin诱导HT22细胞发生铁死亡，检测p53对此模型的作用。如Fig 2B所示，Erastin(0.25、0.5、1 μmol·L-1)明显抑制HT22细胞活力，当Erastin浓度为0.5 μmol·L-1时，HT22细胞存活率约为35% (P＜0.01)，故选择0.5 μmol·L-1作为后续实验的合适损伤浓度。使用1 μmol·L-1 Tenovin-1预处理6 h引起HT22细胞p53高表达后，结果显示，HT22细胞高p53状态可明显抑制Erastin引起的细胞死亡(P＜0.01)。
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| Fig 2 HT22 cell viability inhibited by different concentrations of Glu and erastin, cell damage induced by Glu and erastin attenuated by p53 in HT22 cells (x±s, n=3) A: Glutamate reduced the survival rate of HT22 cells and p53 attenuated the damage induced by glutamate in HT22 cells; B: Erastin decreased the survival rate of HT22 cells and p53 attenuated the damage induced by erastin in HT22 cells.**P < 00.01 vs control; ##P < 00.01 vs Glu or erastin. |
如Fig 3所示，Glu处理8 h后，HT22细胞内ROS水平相较于对照组明显增加(P＜0.01)；与Glu组相比，Glu-p53组ROS水平明显下降(P＜0.01)。
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| Fig 3 Glu-induced intracellular ROS reduced by p53 in HT22 cells (x±s, n=3) **P < 00.01 vs control; ##P < 00.01 vs Glu |
如Fig 4A所示，Glu处理8 h后，HT22细胞内脂质氧化的水平相较于对照组上升了约4倍，而与Glu组相比，Glu-p53组脂质氧化的水平明显下降(P＜0.01)。4-HNE是细胞脂质代谢的产物，当细胞发生脂质氧化后，其细胞内含量会明显上升。如Fig 4B所示，当Glu处理8 h后，4-HNE细胞内含量相较于对照组明显上升(P＜0.01)，而在Glu-p53组4-HNE水平明显下降(P＜0.01)。
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| Fig 4 Glu-induced lipid oxidation decreased by p53 in HT22 cells (x±s, n=3) A:p53 reduced lipid ROS in HT22 cells induced by glutamate; B: p53 decreased expression of 4-HNE in HT22 cells induced by glutamate(scale bar=100 μm).**P < 00.01 vs control; ##P < 00.01 vs Glu. |
如Fig 5所示，与对照组相比，Glu组HT22细胞内Fe2+浓度上升约4倍(P＜0.01)，而与Glu组相比，Glu-p53组HT22胞内Fe2+浓度明显下降(P＜0.01)。表明p53高表达明显抑制了Glu所引起的Fe2+浓度的增加。
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| Fig 5 Glu-induced intracelluar increase of divalent iron ions reduced by p53 in HT22 cells (x±s, n=3) **P < 00.01 vs control; ##P < 00.01 vs Glu |
如Fig 6A所示，与对照组相比，Glu组xCT蛋白表达水平下降(P＜0.05)；而与Glu组相比，Glu-p53组xCT蛋白表达明显上升(P＜0.05)。在经典铁死亡诱导剂Erastin损伤模型中(Fig 6B)，与对照组相比，Era组xCT蛋白表达水平明显抑制(P＜0.01)；与Era组相比，Era-p53组xCT蛋白表达水平明显上升(P＜0.05)。
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| Fig 6 Glu and erastin induced inhibition of xCT protein expression increased by p53 in HT22 cells (x±s, n=3) A: p53 increased the expression of xCT in HT22 cells reduced by glutamate; B: p53 increased the expression of xCT in HT22 cells reduced by erastin. *P < 00.05, **P < 00.01 vs control; #P < 00.05 vs Glu or Era. |
铁死亡是以脂质氧化和铁依赖性途径为特征的细胞调节性坏死，它与传统的caspase依赖性的凋亡和已确定通路的细胞坏死不同。近年来，有研究显示，铁死亡与帕金森病、阿尔茨海默病、亨廷顿舞蹈症之间可能存在着密不可分的联系[8-11]。
有研究表明，在肺癌和骨肉瘤等细胞中，铁死亡的发生与p53的激活密不可分, 此过程主要依赖System Xc-的主要组成部分xCT的直接转录抑制，并且发现p53蛋白的乙酰化，对其调节铁死亡和肿瘤的抑制作用发挥至关重要的影响[12]。故本研究使用了Glu损伤模型模拟神经退行性疾病中的氧化应激损伤，选取HT22细胞作为研究对象。结果发现，p53不仅没有增加HT22细胞对Glu损伤的敏感性，反而使HT22细胞抵抗了Glu对其的神经毒性。而铁死亡在其中发挥了什么作用，我们进行了进一步的研究。
我们又使用了铁死亡经典诱导剂Erastin来诱导HT22细胞发生铁死亡，首先使用Tenvion-1对HT22细胞预处理6 h诱导高p53状态，然后使用Erastin诱导铁死亡。结果发现，相较于Era组，Era-p53组细胞存活率明显上升，说明p53可抵抗HT22细胞发生铁死亡。为了验证在Glu损伤模型中，是否也是因为p53抑制了铁死亡，进而使HT22细胞能够抵抗Glu神经毒性，我们进一步检测了HT22细胞在高p53状态和正常状态下，Glu作用后的铁死亡相关指标的改变情况。发现相较于Glu组，Glu-p53组细胞内ROS、脂质氧化和Fe2+的水平均明显下降，提示p53确实是抑制了HT22细胞发生铁死亡，从而使HT22细胞能够抵抗Glu的神经毒性。
由于有研究表明，在肺癌和骨肉瘤细胞中，p53增加肿瘤细胞对铁死亡的敏感性可能是因为调节了xCT蛋白的表达[7]。为了进一步探讨p53抵抗铁死亡可能的机制，我们检测了HT22细胞中xCT蛋白表达情况，发现Glu组和Era组，xCT蛋白表达被抑制，这也验证了之前的研究[13]。而在Glu-p53组和Era-p53组中，xCT蛋白表达的抑制被不同程度逆转，但p53是否直接调控xCT蛋白表达，以及通过何种途径进行调控尚不清楚。本实验认为，xCT在p53抑制Glu和Erastin损伤中起着关键的作用，但没有对xCT进行沉默，观察p53保护作用的改变，故此有待进一步研究。本实验对p53在神经退行性疾病中与铁死亡作用的探讨主要在HT22细胞上进行，HT22细胞为小鼠海马神经元细胞系，来自于HT4细胞系，正常状态下贴壁生长，因缺乏离子通道型谷氨酸受体，故适宜作为研究Glu氧化应激损伤模型，广泛应用于很多神经退行性疾病的研究。但其不同于原代神经细胞和动物体内神经元，因而p53在原代神经细胞和动物体内的作用仍需进一步研究。
综上所述，本研究表明，p53可通过抑制铁死亡，使HT22细胞抵抗Glu产生的神经毒性。此研究为p53在神经退行性疾病中的作用和机制提供了新的研究思路。
( 致谢: 本实验在安徽医科大学药学院教育部抗炎免疫药物重点实验室完成，感谢各位老师和同学的帮助。)
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