2. 南京中医药大学医学与生命科学学院药理系,江苏 南京 210023;
3. 南京中医药大学附属苏州市中医医院苏州市吴门医派研究院,江苏 苏州 215003
江国荣(1963-),男,博士,主任中药师,研究方向:中药药理学,通讯作者,E-mail: guorongjiang@hotmail.com
2. Dept of Pharmacology, School of Medicine and Life Sciences, Nanjing University of Chinese Medicine, Nanjing 210023, China;
3. Suzhou Wu Men Yi Pai Research Institute, the Affiliated Suzhou Hospital of TCM of Nanjing University of Chinese Medicine, Suzhou Jiangsu 215003, China
过敏性反应是机体受到过敏原,如花粉、屋尘螨(house dust mite, HDM)等诱导后,引起的病理性组织损伤或者功能紊乱的一种免疫反应。过敏性疾病主要包括过敏性哮喘、过敏性皮炎、过敏性鼻炎等,其中患病率及复发率最高的为过敏性哮喘。据Global Burden of Disease Study资料显示,全球约有2.4亿过敏性哮喘患者,预计到2025年将达到3亿,并且有研究显示,该数值近年内将持续上升[1]。过敏性哮喘是一种变应原或其他因素引起的肺功能失常[2],以适应性的2型辅助性T细胞(type 2 T helper cell, Th2)功能异常为主要特征的2型免疫反应。发病时,主要伴随着Th2型细胞因子白介素(interleukin, IL)-4、IL-5、IL-13的产生,表现为嗜酸性粒细胞(eosinophils, EOS)增多、黏液分泌旺盛、气道高反应性,以及E型免疫球蛋白(immunoglobulin E, IgE)的表达增加。过敏性哮喘的病因及发病机制十分复杂[3],目前尚未被完全了解,因此,进一步研究过敏性哮喘的发病机制,并建立有效的干预或治疗手段,对于降低其发病率、复发率尤为重要。
20世纪末,美国学者Dixit等[4]通过实验,首次发现了锌指蛋白A20,因其最初是由肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor α, TNF-α)诱导内皮细胞产生的,所以又被称为肿瘤坏死因子α诱导蛋白3(tumor necrosis factor alpha-induced protein 3, TNFAIP3)。随着对于A20的深入研究,目前它被认为是炎症信号通路的关键调控因子,主要是核转录因子κB(nuclear factor κB, NF-κB)的一种负调控因子,可以通过多种途径抑制NF-κB的活化。目前已有若干报道证实,A20参与了过敏性疾病的发生和发展[5-6],其在过敏性哮喘的发病机制中的重要作用也越来越被重视。因此,对A20与过敏性哮喘的最新研究进展进行综述,有利于为过敏性哮喘的预防和治疗提供新思路。
1 A20的起源与结构锌指蛋白A20,根据其cDNA克隆数而命名,是一种具有高度生物活性的胞质蛋白质。研究发现,人类的A20基因序列定位于染色体中6q23.3位,其cDNA全长为4 426 bp,发挥转录活性作用的可读区域框为2 370 bp(67~2 436 bp)。人的A20蛋白总共由790个氨基酸组成,蛋白分子质量为90 ku。进一步对其蛋白结构分析可知,A20属于去泛素化酶(deubiquitinating enzymes, DUBS)卵巢肿瘤(ovarian tumor, OTU)家族的一种,其N末端区(1~385)含有的半胱氨酸蛋白酶类OTU是A20蛋白的特征性结构区域之一[7]。同时,A20蛋白也具有泛素化功能,A20蛋白的锌指结构区在其C末端(386~775),该锌指区域由7个Cys2-Cys2结构组成[8],其中第4个结构区具有E3泛素连接酶活性,可特异性地与底物结合,招募26S蛋白酶体,将靶蛋白降解。正是因为这两种特殊的蛋白结构(Fig 1),A20蛋白具有了泛素化和去泛素化双重功能,在炎症调节中起着重要作用。
2 A20的生物学功能A20是一种具有高度保守性的、胞质诱导表达性蛋白,其在上皮细胞、T淋巴细胞、B淋巴细胞、树突状细胞等中均有表达。已有研究表明,A20作为NF-κB的负调控因子,在多种炎症性反应中扮演着重要的角色。A20蛋白可在多种促炎因子,如细菌脂多糖(lipopolysaccharides, LPS)、TNF-α、IL-1等刺激细胞后大量表达,其中,A20基因3’端非翻译区含有的4个“ATTTA”序列,是A20蛋白快速表达的基础。尽管目前广泛认为A20是一种存在于细胞质中的抗炎蛋白,但最初研究发现其是一种能够保护由TNF-α诱导细胞毒性的蛋白质。进一步研究发现,A20可以通过不同途径,抑制TNF-α诱导的NF-κB的活化,除此之外,还可以抑制由CD40、IL-1,以及包括模式识别受体(pattern recognition receptor, PRR)等在内诱导的NF-κB的活化,并且还可以抑制T细胞和B细胞抗原受体的激活[8]。A20在多种炎症反应中起着重要作用,特异性敲除小鼠体内A20基因不久后,小鼠体内多种器官即可产生炎症反应,并且缺失A20蛋白的细胞无法阻断由刺激因子诱导的NF-κB的活化。除此之外,近年来A20还被报道能调节其他细胞信号转导通路,如Wnt通路、干扰素调节因子(interferon regulatory factor, IRF)、自噬应答等途径。研究发现,A20还可以通过直接结合白细胞介素17受体A(interleukin-17 receptor type A, IL-17RA)的C末端结构域,来抑制IL-17信号转导,并且A20可以抑制TNFR、IL-1R和NOD样受体(NOD like receptors, NLR)信号通路,但是A20是否直接与这些受体结合,尚待考证。
TNF受体1(TNF receptor 1, TNFR1)能够激活NF-κB活化的信号转导途径,A20被认为能通过调节该通路而成为炎症性疾病的潜在治疗靶点(Fig 2)。众所周知,蛋白质泛素化是生物体内的一种重要调节方式。该过程通过对靶蛋白进行一系列的特异性修饰后,即可招募26S蛋白酶体,将靶蛋白降解,其中起蛋白质降解标签作用的为K48多聚泛素蛋白链。除此之外,蛋白质的泛素化也可以进行信号转导,这主要依赖于K63多聚泛素蛋白链的作用,其可以被特异性的调控因子识别,启动相应信号[9]。A20被普遍认为是一种NF-κB信号的经典负调控因子,且已有文献证明,A20是一种泛素编辑酶复合体,同时具有E3泛素连接酶和DUB去泛素化酶活性。目前认为,A20抑制NF-κB信号的机制一方面是因其蛋白N末端的OTU结构域[7],而受体相互作用蛋白激酶1(receptor interacts with the protein kinase 1, RIP1)、肿瘤坏死因子受体相关因子6(tumor necrosis factor receptor- associated factor 6, TRAF6)和NF-κB必需调节蛋白(NF-κB- essential modulator, NEMO)等为OTU结构域的结合底物[10-12],并且RIP1、TRAF6、NEMO等被激活后,均能募集泛素蛋白聚合,形成K63多聚泛素化链。因此,A20能够特异性地趋向K63链,破坏其多聚泛素化链完整性,从而阻断相关信号的转导[10]。除了去泛素化活性之外,A20蛋白第4个锌指结构区域ZF4所具有的泛素连接酶功能,也参与NF-κB的抑制作用。A20的E3泛素连接酶活性能促进RIP1募集以lys48位点连接为主的泛素蛋白的多聚化,也就是可以促进靶蛋白附着K48多聚泛素化链,从而招募26S蛋白酶体降解RIP1,阻断下游的信号转导。除此之外,研究还发现,A20可以通过去泛素化黏膜相关淋巴组织淋巴瘤易位蛋白1(mucosa-associated lymphoid tissue lymphoma translocation protein 1, MALT1),负调控由T细胞受体(T cell receptor, TCR)诱导的NF-κB的活化。在淋巴细胞中,TRAF6对MALT1的泛素化也是NF-κB活化所必需的[13]。A20的生物学功能依赖于其蛋白结构基础,随着研究的发展,A20蛋白的更多功能也将会被发现。
3 A20与过敏性哮喘过敏性哮喘是儿童和成人中最常见的慢性非传染性疾病之一,其特征是以呼吸道症状多变、气流受限为主。过敏性哮喘异质性强,是由环境和基因相互作用的结果,发病后出现严重的气道炎症和气道重塑[3]。目前,过敏性哮喘的治疗目标主要是实现对其良好的控制,尽量缓解过敏性哮喘症状,以及降低疾病复发几率。抗炎以及支气管扩张药物的使用是治疗过敏性哮喘的主要手段,尽管这些手段广泛应用于临床,但仍难以缓解恶性哮喘的发病症状,也无法防止哮喘的复发。目前,全球有很多机构都在研究过敏性哮喘,但其发病机制仍不明确。A20作为NF-κB的负调控因子,能够有效调节炎症反应,在过敏性哮喘中的研究也逐渐受到了重视。
目前,主要用于治疗过敏性哮喘的为糖皮质激素(glucocorticoid, GC)类药物,可以有效缓解气道炎症以及哮喘症状。GC既可以促进抗炎因子分泌,又可抑制许多促炎因子的表达[14]。糖皮质激素受体(glucocorticoid receptor, GR)是一种存在于细胞质中的转录因子,通过与GC特异性结合后转入到细胞核,参与相关基因调控。GC的治疗作用与A20的表达有关,Altonsy等[5]研究发现,特异性敲除A20后能明显增加人支气管上皮细胞分泌TNF-α,并且长效β2受体激动剂(longacting β2-adrenoceptor agonists, LABAs)能通过增加A20的表达,负调控NF-κB的活化,进而提高吸入性GC的抗炎作用。GC的抗炎作用还可通过与GR结合,促进抗炎因子A20和NFBIA基因、蛋白的表达[15]。
A20功能紊乱能够引起包括哮喘等多种免疫性疾病,但也有研究证明,A20可以限制过敏性气道炎症和耐受反应[6]。研究发现,A20参与了低剂量LPS诱导的免疫耐受。持续给予小鼠低剂量LPS,能够增强HDM诱导的哮喘小鼠的耐受性,支气管肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid, BALF)和肺组织匀浆中IL-4、IL-5、IL-13的表达明显减少。而特异性敲除小鼠上皮细胞A20基因(Tnfaip3EC-KO)后,可明显影响LPS诱导的免疫耐受、过敏性哮喘模型外周血中嗜酸性粒细胞数目,以及BALF和肺组织匀浆中IL-4、IL-5、IL-13表达均明显增加[6]。Tan等[16]发现,灭活的铜绿假单胞菌药剂能够通过降低Act1,以及增加TLR4、A20的表达,来抑制卵清蛋白(ovalbumin, OVA)引起的过敏性气道炎症。此外,A20也参与了锌对哮喘的调控机制。Morgan等[17]发现,短期锌处理组并未改变A20和TRAF6水平,但是导致了RIP1(IKK上游一种重要的激活因子)的降解。为进一步确定锌作为哮喘治疗剂的应用效果,随后建立过敏性气道炎症模型,给予锌治疗,结果表明锌补充剂能够通过调节A20活性而抑制NF-κB的表达,同时,补锌后可以降低气道高反应性和血清中IgE水平,但对Th2型细胞因子表达无影响。因此,补充锌可能是治疗哮喘的一种潜在方法,并且主要是通过调控A20的表达而实现的。
过敏性哮喘的发生伴随着大量Th2型细胞因子IL-4、IL-5、IL13的表达,在哮喘发病的初始阶段,2型固有淋巴细胞(type 2 innate lymphoid cell, ILC2)是经典的,除了2型辅助性T细胞以外的Th2型细胞因子的主要来源之一。哮喘患者BALF和唾液中能够检测到大量ILC2的存在[18],并且ILC2已被报道在炎症反应、组织修复以及代谢平衡中十分重要,因此,ILC2与过敏性哮喘关系密切。与此同时,miRNAs作为调控基因表达的重要因子,在过敏性哮喘的研究中也逐渐受到重视[19]。研究发现,miR-19a能够通过抑制ILC2中A20和SOCS1蛋白、基因的表达,从而促进IL-4、IL-5、IL-13的分泌[20]。在外源OVA诱导产生的小鼠过敏性肺部炎症模型中,当体内转染入含有A20 cDNA(Ad-A20)的腺病毒后,能够明显减少气道炎症性细胞的募集,减轻气道高反应性及支气管炎症的发生,并且Ad-A20的保护性作用是通过抑制NF-κB信号转导途径实现的。HDM诱导的过敏性哮喘小鼠肺匀浆中A20(通过调节关键信号蛋白TRAF6的泛素化来抑制TLR反应)、IRAKM(结合MyD88和TRAF6,可以阻断TLR作用,稳定信号复合物)、Tollip(与IL-1R、TLR2和TLR4相互作用以防止细胞激活,并抑制IRAK自磷酸化)均有明显增加[21]。且有报道表明,哮喘组中肺组织TGF-β1和CTCF mRNA水平与正常组相比明显上升,而体内给予外源性A20重组蛋白后明显下降,提示外源性A20对于气道上皮增生、平滑肌增殖的抑制作用与降低TGF-β1、CTCF的表达有关。
总之,目前A20均被视为一种抗炎蛋白,可以有效抑制各种炎症信号通路转导。除了传统的一些炎症信号外,近年来也发现了A20的一些新的调控因素。NLRP3作为一种炎症小体,参与了多种疾病的发生,哮喘患者体内能够检测到NLRP3的高表达,并且HDM诱导的小鼠过敏性哮喘模型中能够激活NLRP3炎症小体的组装。A20是TNF-α诱导的NF-κB信号激活通路的有效抑制剂,A20的缺失能够导致IL-1β的表达增加[22],并且A20可以抑制NLRP3炎症小体的激活[23],说明A20可以通过调控NLRP3的表达,缓解过敏性哮喘的炎症状态。此外,A20还可以调控一些转录因子的表达。JAK-STAT是一种经典的信号通路,膜受体活化后,能够引起JAKs的磷酸化,随后募集STATs,通过Src同源体2(Src homology 2, SH2)结构域与受体结合,经过JAKs信号传递引起STATs的磷酸化,进一步形成STATs二聚体,进入核内与DNA启动子结合,启动靶基因转录。JAK-STAT通路参与了Th2细胞的分化,并且IL-4、IL-13与其受体IL-4Rα、IL-13Rα结合后,也可激活JAK-STAT通路。De Wilde等[24]发现,小鼠体内特异性敲除A20基因后,IRF4、STAT1的表达明显增加。Lee等[25]研究表明,小鼠体内过表达A20蛋白后,可以明显改善小鼠溃疡性结肠炎的炎症表现,并且过表达A20后,转录因子p-p65和p-STAT3的表达均明显减少。因此,A20可通过多种途径调控哮喘的发生。随着研究的进一步发展,A20更多的调控功能也将会被发现,其可能成为治疗过敏性哮喘的一个潜在新靶点。
4 小结越来越多的结果显示,A20在过敏性哮喘中扮演着重要的作用,参与了多种过敏性疾病的发生、发展。目前普遍认为A20主要是NF-κB的一种负调控因子,在参与过敏性哮喘发生的支气管上皮细胞及免疫细胞(如Th2细胞、ILC2等)中的研究较为广泛,但其具体调控机制仍不清楚。体内特异性敲除A20后,能够加重过敏性哮喘发病症状,给予重组A20能够明显缓解炎症反应,这些反应主要是依赖于A20蛋白与RIP1、NEMO、TRAF6等特异性结合后,发挥泛素化和去泛素化双重功能,起到信号抑制作用。除此之外,也有最新研究发现,A20可以调控IRF4、STAT3、STAT6等转录因子的表达,以及NLRP3炎症小体的组装,但是具体方式仍不清楚,提示A20可能存在多种负调控机制,并且其可能是治疗哮喘的潜在靶点。过敏性哮喘发病机制复杂,其多复发性成为世界性的难题,因此,对A20进行基因解析、蛋白质结构分析及调控机制探讨,对于过敏性哮喘的预防和治疗具有重大意义。
[1] |
Fehrenbach H, Wagner C, Wegmann M. Airway remodeling in asthma: what really matters[J]. Cell Tissue Res, 2017, 367(3): 551-69. doi:10.1007/s00441-016-2566-8 |
[2] |
魏盼, 李恋曲, 吴鹏, 等. 上皮间质转化与哮喘气道重塑的研究进展[J]. 中国药理学通报, 2018, 34(5): 600-3. Wei P, Li L Q, Wu P, et al. Advances in epithelial-mesenchymal transition and airway remodeling in asthma[J]. Chin Pharmacol Bull, 2018, 34(5): 600-3. doi:10.3969/j.issn.1001-1978.2018.05.003 |
[3] |
Papi A, Brightling C, Pedersen S E, et al. Asthma[J]. Lancet, 2018, 391(10122): 783-800. doi:10.1016/S0140-6736(17)33311-1 |
[4] |
Dixit V M, Green S, Sarma V, et al. Tumor necrosis factor-alpha induction of novel gene products in human endothelial cells including a macrophage-specific chemotaxin[J]. J Biol Chem, 1990, 265(5): 2973-8. |
[5] |
Altonsy M O, Mostafa M M, Gerber A N, et al. Long-acting beta2-agonists promote glucocorticoid-mediated repression of NF-kappaB by enhancing expression of the feedback regulator TNFAIP3[J]. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol, 2017, 312(3): L358-70. doi:10.1152/ajplung.00426.2016 |
[6] |
Schuijs M J, Willart M A, Vergote K, et al. Farm dust and endotoxin protect against allergy through A20 induction in lung epithelial cells[J]. Science, 2015, 349(6252): 1106-10. doi:10.1126/science.aac6623 |
[7] |
Evans P C, Ovaa H, Hamon M, et al. Zinc-finger protein A20, a regulator of inflammation and cell survival, has de-ubiquitinating activity[J]. Biochem J, 2004, 378(Pt 3): 727-34. |
[8] |
Beyaert R, Heyninck K, Van Huffel S. A20 and A20-binding proteins as cellular inhibitors of nuclear factor-kappa B-dependent gene expression and apoptosis[J]. Biochem Pharmacol, 2000, 60(8): 1143-51. doi:10.1016/S0006-2952(00)00404-4 |
[9] |
Li S, Zhao J, Shang D, et al. Ubiquitination and deubiquitination emerge as players in idiopathic pulmonary fibrosis pathogenesis and treatment[J]. JCI Insight, 2018, 3(10): e120362. doi:10.1172/jci.insight.120362 |
[10] |
Boone D L, Turer E E, Lee E G, et al. The ubiquitin-modifying enzyme A20 is required for termination of Toll-like receptor responses[J]. Nat Immunol, 2004, 5(10): 1052-60. doi:10.1038/ni1110 |
[11] |
Wertz I E, Dixit V M. Signaling to NF-kappaB: regulation by ubiquitination[J]. Cold Spring Harb Perspect Biol, 2010, 2(3): a003350. |
[12] |
Mauro C, Pacifico F, Lavorgna A, et al. ABIN-1 binds to NEMO/IKKgamma and co-operates with A20 in inhibiting NF-kappaB[J]. J Biol Chem, 2006, 281(27): 18482-8. doi:10.1074/jbc.M601502200 |
[13] |
Abbasi A, Forsberg K, Bischof F. The role of the ubiquitin-editing enzyme A20 in diseases of the central nervous system and other pathological processes[J]. Front Mol Neurosci, 2015, 8: 21. |
[14] |
Gerber A N. Glucocorticoids and the lung[J]. Adv Exp Med Biol, 2015, 872: 279-98. doi:10.1007/978-1-4939-2895-8 |
[15] |
Kadiyala V, Sasse S K, Altonsy M O, et al. Cistrome-based cooperation between airway epithelial glucocorticoid receptor and NF-kappaB orchestrates anti-inflammatory effects[J]. J Biol Chem, 2016, 291(24): 12673-87. doi:10.1074/jbc.M116.721217 |
[16] |
Tan Y, Liu H, Yang H, et al. An inactivated Pseudomonas aeruginosa medicament inhibits airway allergic inflammation and improves epithelial functions[J]. J Physiol Sci, 2013, 63(1): 63-9. doi:10.1007/s12576-012-0231-x |
[17] |
Morgan C I, Ledford J R, Zhou P, et al. Zinc supplementation alters airway inflammation and airway hyperresponsiveness to a common allergen[J]. J Inflammation, 2011, 8(1): 36. |
[18] |
Klose C S, Artis D. Innate lymphoid cells as regulators of immunity, inflammation and tissue homeostasis[J]. Nat Immunol, 2016, 17(7): 765-74. doi:10.1038/ni.3489 |
[19] |
王晓钰, 于曦, 王燕, 等. MicroRNAs:过敏性疾病的潜在新靶点[J]. 中国药理学通报, 2016, 32(5): 616-9. Wang X Y, Yu X, Wang Y, et al. MicroRNAs: potential new targets of allergic disease[J]. Chin Pharmacol Bull, 2016, 32(5): 616-9. doi:10.3969/j.issn.1001-1978.2016.05.006 |
[20] |
Singh P B, Pua H H, Happ H C, et al. MicroRNA regulation of type 2 innate lymphoid cell homeostasis and function in allergic inflammation[J]. J Exp Med, 2017, 214(12): 3627-43. doi:10.1084/jem.20170545 |
[21] |
Habibzay M, Saldana J I, Goulding J, et al. Altered regulation of Toll-like receptor responses impairs antibacterial immunity in the allergic lung[J]. Mucosal Immunol, 2012, 5(5): 524-34. doi:10.1038/mi.2012.28 |
[22] |
Oda H, Kastner D L. Genomics, biology, and human illness: advances in the monogenic autoinflammatory diseases[J]. Rheum Dis Clin North Am, 2017, 43(3): 327-45. doi:10.1016/j.rdc.2017.04.011 |
[23] |
Duong B H, Onizawa M, Oses-Prieto J A, et al. A20 restricts ubiquitination of pro-interleukin-1beta protein complexes and suppresses NLRP3 inflammasome activity[J]. Immunity, 2015, 42(1): 55-67. doi:10.1016/j.immuni.2014.12.031 |
[24] |
De Wilde K, Martens A, Lambrecht S, et al. A20 inhibition of STAT1 expression in myeloid cells: a novel endogenous regulatory mechanism preventing development of enthesitis[J]. Ann Rheum Dis, 2017, 76(3): 585-92. doi:10.1136/annrheumdis-2016-209454 |
[25] |
Lee S H, Lee H R, Kwon J Y, et al. A20 ameliorates inflammatory bowel disease in mice via inhibiting NF-kappaB and STAT3 activation[J]. Immunol Lett, 2018, 198: 44-51. doi:10.1016/j.imlet.2018.03.015 |