2. 药用美洲大蠊四川省重点实验室，四川 成都 610000
2. Key Lab of Periplaneta americana in Sichuan Province, Chengdu 610000, China
溃疡性结肠炎(ulcerative colitis，UC)与人体肠道菌群的组成和改变密切相关[1]。复方蜚蠊提取物PA、PB、PC[P4]中的君药蜚蠊学名美洲大蠊(Periplaneta americana L.)，有促进组织修复、调节免疫的作用[2-3]。本实验研究复方蜚蠊提取物对慢性UC大鼠肠道菌群的影响。
1 材料 1.1 实验动物SPF级SD大鼠96只，♀♂各半，购自湖南斯莱克景达实验动物有限公司，许可证号：SCXK(湘)2016-0004，饲养于大理大学动物中心。
1.2 仪器StepOne Plus RT-PCR型实时荧光定量PCR仪(ABI公司)；DYY-12型电泳仪(北京市六一仪器厂)；InGenius型凝胶成像分析系统(SYNGENE公司)；NANODROP2000型核酸蛋白分析仪(Thermo公司)。
1.3 药物与试剂复方蜚蠊提取物(云南省昆虫生物医药研发重点实验室提供)；粪便基因组DNA提取试剂盒(TIANGEN)；SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR预混液UNG(含ROX)、DNA分子量标准Marker(GenStar)。抗原乳化液[2]：取家兔结肠抗原，生理盐水溶解后，加入等量完全弗氏佐剂制成。
1.4 荧光定量PCR引物分别以硫酸盐还原菌特有的功能酶基因序列，拟杆菌属、双歧杆菌属、乳酸杆菌属、大肠埃希菌种、肠球菌属及总菌群的16S rDNA基因序列，设计菌种特异性PCR引物[3](Tab 1)，引物由上海生工生物工程公司合成。
| Target species | Sequence | Length/bp |
| Total flora | F: 5′-TCCTACGGGAGGCAGCAGT-3′ | |
| R: 5′-GGACTACCAGGGTATCTAATCCTGTT-3′ | 331 | |
| Bacteroides | F: 5′-CTGAACCAGCCAAGTAGCG-3′ | |
| R: 5′-CCGCAAACTTTCACAACTGACTTA-3′ | 200 | |
| Bifidobacterium | F: 5′-TCGCGTC(C/T)GGTGTGAAAG-3′ | |
| R: 5′-CCACATCCAGC(A/G)TCCAC-3′ | 243 | |
| Lactobacillus | F: 5′-AGCAGTAGGGAATCTTCCA-3′ | |
| R: 5′-CACCGCTACACATGGAG-3′ | 341 | |
| Escherichia coli | F: 5′-GTTAATACCTTTGCTCATTGA-3′ | |
| R: 5′-ACCAGGGTATCTTAATCCTGTT-3′ | 340 | |
| Enterococcus | F: 5′-CCCTTATTGTTAGTTGCCATCATT-3′ | |
| R: 5′-ACTCGTTGTACTTCCCATTGT-3′ | 144 | |
| Sulfate-reducing Bacteria | F: 5′-CCAACATGCACGGYTCCA-3′ | |
| R: 5′-CGTCGAACTTGAACTTGAACTTGTAGG-3′ | 270 |
参照文献[2]的方法造模，大鼠随机分为正常组、模型组、柳氮磺胺吡啶(sulfasalazine, SASP)组(300 mg·kg-1)、复方蜚蠊提取物PA、PB、PC高、中、低剂量组(200、100、50 mg·kg-1)，正常组和模型组灌肠给予生理盐水2.5 mL·kg-1，其余各组灌肠给予相应药物(2.5 mL·kg-1)，每日给药1次，连续给药14 d。
2.2 粪便采集与病理学观察末次给药后24 h，收集结肠粪便。HE染色制作结肠病理切片，光学显微镜下观察。
2.3 粪便DNA的提取所有粪便采用粪便基因组DNA提取试剂盒提取，按照说明书操作。
2.4 标准曲线的制作复苏、扩增菌液，提取质粒作为PCR的标准品，用核酸蛋白分析仪检测260 nm波长下的OD值及浓度，用于制作标准曲线。
2.5 实时荧光定量PCR反应将待测粪便样本中提取的DNA进行PCR反应。根据熔解曲线，分析PCR产物的特异性，并由StepOne Plus PCR仪分析定量结果。
2.6 数据统计与分析样本定量数据用x±s表示，应用SPSS 21.0软件统计分析，多组比较用单因素方差分析，两组间比较采用t检验进行。
3 结果 3.1 结肠黏膜病理学观察在显微镜下观察大鼠结肠组织病理切片，可见正常组大鼠结肠的结构完整清晰；造模组大鼠结肠黏膜上皮出现破损、杯状细胞大量丢失，黏膜层炎性细胞浸润，提示造模成功。
3.2 粪便细菌的定量结果每个粪便DNA样本所含细菌拷贝浓度可通过标准曲线比较得到，由PCR仪得出定量结果(Tab 2)，各组大鼠粪便样本总菌群数量差异无显著性；与正常组相比，UC模型组双歧杆菌、乳酸杆菌数量明显减少(P < 0.05)，大肠埃希菌、肠球菌与硫酸盐还原菌数量有增加趋势。
| Group | Dose/mg·kg-1 | Total flora | Bacteroides | Bifidobacterium | Lactobacillus | Escherichia coli | Enterococcus | Sulfate-reducing bacteria |
| Control | - | 7.02±0.15 | 5.46±0.25 | 4.92±0.30 | 5.13±0.67 | 3.14±0.46 | 2.16±0.35 | 3.77±0.21 |
| Model | - | 7.05±0.13 | 5.75±0.38 | 4.13±0.28* | 4.48±0.32* | 3.76±0.54 | 2.57±0.63 | 4.22±0.18 |
| SASP | 300 | 7.06±0.21 | 5.50±0.40 | 4.14±0.33* | 4.81±0.47 | 3.67±0.98 | 2.40±0.39 | 3.83 ±0.36 |
| PA | 50 | 7.05±0.18 | 5.72±0.35 | 4.20±0.28* | 4.47±0.41* | 3.17±0.49 | 2.64±0.63 | 3.67±0.44# |
| 100 | 6.98±0.19 | 5.78±0.25 | 4.30±0.26* | 4.60±0.49 | 3.92±0.67 | 1.95±0.41# | 3.62±0.68# | |
| 200 | 6.93±0.14 | 5.73±0.47 | 4.41±0.40* | 4.80±0.47 | 3.96±1.23 | 1.79±0.31##△ | 3.47±0.37## | |
| PB | 50 | 7.01±0.13 | 5.51±0.27 | 4.28±0.47* | 4.92±0.40 | 3.74±0.73 | 2.53±0.60 | 3.96±0.42 |
| 100 | 7.15±0.18 | 5.79±0.32 | 4.31±0.32* | 4.47±0.37* | 4.90±1.10*#△△ | 2.38±0.50 | 3.94±0.44 | |
| 200 | 7.03±0.22 | 5.66±0.29 | 4.36±0.23* | 4.49±0.64* | 4.42±0.61* | 2.46±0.55 | 3.84±0.36 | |
| PC | 50 | 6.90±0.15 | 5.42±0.37 | 4.41±0.18* | 5.30±0.29## | 4.36±1.06* | 2.75±0.62* | 3.40±0.17## |
| 100 | 6.92±0.14 | 5.35±0.16# | 4.25±0.21* | 4.61±0.32 | 4.14±0.57* | 2.33±0.30 | 3.30±0.21##△ | |
| 200 | 6.89±0.13 | 5.39±0.34# | 4.10±0.60* | 3.97±0.31**△△ | 2.97±0.19 | 1.64±0.32##△ | 3.03±0.66**##△△ | |
| *P < 0.05, **P < 0.01 vs control; #P < 0.05, ##P < 0.01 vs model; △P < 0.05, △△P < 0.01 vs SASP | ||||||||
肠道菌群对于维持肠道内环境稳定起重要作用，肠道中菌群发生紊乱，容易导致很多肠道炎症性疾病发生[4]。本研究发现，复方蜚蠊提取物PA、PB、PC作用于UC大鼠可使肠道中双歧杆菌、乳酸杆菌数量有不同程度增加，而PA、PC作用于UC大鼠可使具有条件致病性的大肠埃希菌、肠球菌、硫酸盐还原菌数量有不同程度减少，提示复方蜚蠊提取物对调节肠道菌群具有一定作用，对维持肠道黏膜的平衡有一定的意义。本研究建立了稳定的UC大鼠模型及合适的肠道微生态干预药物评价指标，为UC治疗药物的后续研究奠定了基础。
( 致谢: 本实验在大理大学昆虫生物医药研发科技创新平台完成，感谢对实验给予帮助的老师和同学！)
| [1] |
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| [2] |
张俊, 魏永凯, 李玥, 等. 美洲大蠊提取物Ento-D对醋酸诱导的急性溃疡性结肠炎大鼠的作用及机制研究[J]. 中华中医药杂志, 2018, 33(1): 304-8. Zhang J, Wei Y K, Li Y, et al. Effects and mechanism of Periplaneta americana extracted Ento-D on aceticacid-induced ulcerative colitis in rats[J]. Chin J Tradit Chin Med, 2018, 33(1): 304-8. |
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