2. 沈阳市妇婴医院生殖医学科，辽宁 沈阳 110011
2. Center of Reproductive Medicine, Shenyang Women′s and Children′s Hospital, Shenyang 110011, China
机体的体温是保持内环境稳态的重要因素之一，除病理性体温明显升高或降低以外，通常还表现出体温的生理性波动，特别是女性在月经周期表现为双相体温的变化，即在卵泡期体温较低，在排卵后基础体温升高约(0.3~0.6) ℃。关于月经周期中的黄体期体温升高的机制，通常认为是孕酮作用在下丘脑的体温调节中枢，进而改变新陈代谢水平或皮肤血流量，但其作用的相关生物学机制还不清楚[1]。
瞬时受体电位香草酸受体4(transient receptor potential vanilloid 4, TRPV4)是瞬时受体电位(transient receptor potential, TRP)蛋白家族成员之一，是位于细胞膜上的一种重要的离子通道，参与体内多种生理功能的调节过程。目前的研究表明，该通道是一种多向的非选择性阳离子通道，可透过Ca2+、K+、Mg2+和Na+，但Ca2+的通透率相对较高[2-3]。在体内，TRPV4可被多种刺激所激活，包括物理因素(如温度、渗透压等)、内源性和外源性化学因素(如特异性激动剂等)以及低pH值(pH<6)[4]。随着对其温度感受特性和渗透压感受特性的研究，TRPV4已被视为体内的热传感器和渗透压传感器[5]。TRPV4通道在哺乳动物大多数组织中均有表达，包括外周神经系统和中枢神经系统，其中在中枢神经系统主要表达在下丘脑、海马、皮层等部位[6]。研究发现，在体温调节中枢下丘脑前部有TRPV4的表达，且在机体的体温调节过程中，特别是对正常体温的维持起重要的作用[7]。本研究主要探讨TRPV4是否参与♀大鼠性周期中孕酮致体温升高的过程。通过预先在体温调节中枢视前区-下丘脑前部(preoptic-anterior hypothalamus area, PO/AH)给予TRPV4特异性阻断剂RN-1734[8-9]，观察RN-1734对大鼠动情后期体温的影响；进一步在去卵巢大鼠腹腔注射孕酮后，于PO/AH区给予RN-1734，观察体温的变化，以明确体温升高与孕酮及TRPV4通道的关联性。
1 材料与方法 1.1 材料 1.1.1 实验动物SPF级健康♀SD大鼠，体质量240~260 g，由中国医科大学实验动物中心提供，动物合格证和使用许可证号分别为:SCXK(辽)013-0001、SYXK(辽)013-0007。饲育室温度(20 ± 2)℃，昼夜光照节律12 h :12 h，相对湿度40%~60%，单笼饲养，自由进食水。实验前，将动物在实验环境中适应1周。以下实验每组均采用6只动物。
1.1.2 试剂孕酮、TRPV4特异性阻断剂RN-1734，均购自MedChem Express公司。
1.1.3 仪器无线BW-200数据采集系统(成都泰盟软件有限公司)；化学发光免疫分析仪(SIEMENS IMMULITE® 2000 XPI[1])。
1.2 方法 1.2.1 大鼠动情周期的观察每天于7 :30~8 :30开始，将待查♀鼠置于空笼子铁丝盖上，用拇指和食指捏住其尾，其余3指压于后腰背部，露出阴道口，将小棉签从阴道口插入阴道并且缓慢转动，抽出后，将黏液均匀涂在载玻片上，待载玻片变干，进行HE染色，用显微镜观察细胞类型的形态。并将♀大鼠随机分为动情前期、动情期、动情后期和动情间期。
1.2.2 观察大鼠在性周期中的体温变化及孕酮水平应用生理无线遥测系统(BW-200)实时监测大鼠体温。将大鼠用10%水合氯醛(3 mg·kg-1)腹腔麻醉，放置在超净台内，仰卧位，四肢固定，腹部用酒精棉消毒，沿腹中线剪开，埋入体温检测发射子，将腹部缝好，用碘伏消毒伤口处，腹腔注射40 000 IU青霉素，处理完毕后，单独饲养1周后，连续观察两个动情周期，监测其体温变化。之后分别在动情前期、动情期、动情后期和动情间期相应时相，取血液样本，将样本存放在抗凝管中，经3 000 r·min-1水平离心10 min，取上清液(即血浆)，置入EP管，-70 ℃保存。然后，将取上清液，用化学发光法检测血中孕酮浓度。
1.2.3 观察不同孕酮水平对去卵巢大鼠体温的影响去卵巢大鼠模型：大鼠麻醉后俯卧位，以肋下1 cm、脊柱旁2 cm处为中心除毛，切开皮肤。在皮肤和肌肉之间扩张、剥离，见包绕卵巢的脂肪组织及紧密相连的子宫，将其拉出，在子宫角的输卵管的部位结扎，切断子宫角，将卵巢摘除后，撒以青霉素粉，分别缝合腹膜与肌层和皮肤。饲育1周后，通过观察阴道分泌物，以明确无明显动情周期。连续观察10 d(约两个动情周期)体温变化，确认体温平稳之后，将大鼠随机分为：①正常对照组(Control)：腹腔注射0.1 mL生理盐水；②溶剂组(Solvent)：腹腔注射0.1 mL溶剂(乙醇:麻油=1 :4)；③孕酮组(Progesterone，用上述溶剂溶解)：腹腔注射孕酮(1、5、25 mg·kg-1)各0.1 mL，观察不同剂量孕酮对机体体温的影响。
1.2.4 观察PO/AH给予RN-1734对正常大鼠动情后期体温波动的影响将大鼠腹腔麻醉后，暴露前囟。在颅骨冠状缝下0.3 mm、矢状缝旁0.8 mm处钻孔，将高度为6.4 mm引导管垂直插入PO/AH区，固定导管。单笼饲养1周后，连续观察两个动情周期大鼠的体温，明确动情后期出现体温最高点的时相，在动情后期体温到达最高点前2 h(通过前期实验表明阻断剂RN-1734在第2 h作用最大)，于PO/AH区分别注射1 μL的生理盐水、溶剂(乙醇:芝麻油=1 :4)和阻断剂RN-1734(0.002 3 μg·kg-1，用上述溶剂溶解), 观察不同实验条件下的体温波动情况。
1.2.5 在预先给予孕酮的去卵巢大鼠的PO/AH给予RN-1734，观察体温波动的变化将去卵巢大鼠随机分为4组：①正常对照组(Control)：腹腔注射0.1 mL溶剂(乙醇:芝麻油=1 :4)，10 h后，在PO/AH区注射1 μL溶剂；②阻断剂组(RN-1734)：腹腔注射0.1 mL溶剂，10 h后，在PO/AH区注射1 μL阻断剂RN-1734(0.002 3 μg·kg-1)；③孕酮组(Progesterone)：腹腔注射0.1 mL孕酮(5 mg·kg-1)，10 h后，在PO/AH区注射1 μL溶剂；④孕酮+阻断剂组(Progesterone+RN-1734)：腹腔注射0.1 mL孕酮(5 mg·kg-1)，10 h后，在PO/AH注射RN-1734阻断剂1 μL(0.002 3 μg·kg-1)。观察不同实验条件下，大鼠的体温波动变化。
1.3 数据处理应用SPSS 19.0软件进行统计分析，所有实验数据均用x±s表示，各组均数间差异性的比较用F检验，相关分析用相关性检验分析法。
2 结果 2.1 阴道涂片确定大鼠动情周期取大鼠阴道分泌物，经涂片、HE染色，显微镜下观察各个时期的特点如下：动情前期可见大量圆形有核细胞(Fig 1A)；动情期可见大量不规则角化细胞(Fig 1B)；动情后期可见圆形有核细胞、角化细胞、白细胞3种细胞并存(Fig 1C)；动情间期可见大量体积小的白细胞(Fig 1D)。
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| Fig 1 HE staining of vaginal secretion on rats(scale bar: 100 μm) A:Proestrus; B: Oestrus; C: Metestrus; D: Diestrus. |
分别在♀大鼠动情前期、动情期、动情后期、动情间期采血，检测血中孕酮浓度。Tab 1结果显示，在动情前期孕酮水平最低，进入动情期逐渐升高，在动情后期达到高峰，随后孕酮水平开始下降。正常♀大鼠在动情周期体温呈波动性变化。在动情前期，体温最低，随后体温上升，到动情后期体温到达最高点，随后开始下降。对比观察可见，大鼠动情周期中血孕酮水平的变化和体温变化的趋势相似，二者呈正相关关系，线性回归曲线Ŷ=36.77X+0.02，相关系数r=0.99。
| Group | Progesterone concentration/nmol·L-1 | Temperature /℃ |
| Proestrus | 47.47±6.76 | 37.61±0.06 |
| Oestrus | 79.20±5.82 | 38.02±0.07 |
| Metestrus | 114.00±6.56 | 38.70±0.09 |
| Diestrus | 78.43±3.81 | 38.00±0.07 |
Fig 2显示了给予去卵巢大鼠孕酮(1、5、25 mg·kg-1)、溶剂和正常对照组的体温变化情况。结果表明，给予孕酮后，出现了剂量依赖性体温升高，即剂量越大，体温升高幅度越大。实验表明，给药12 h后体温升高幅度最大，依据孕酮剂量由低至高，其体温分别达到(39.31±0.06)℃、(39.48±0.07)℃、(39.58±0.08)℃，在给药24 h后，体温基本恢复为基础体温。Tab 2为不同实验条件下，各个时间点体温与基础体温(实验前1周，应用生理无线遥测系统，每隔5 min记录1次体温，取其时间点平均值记为基础体温)的差值，其中孕酮给药浓度为5、25 mg·kg-1，体温均在6 h和12 h时间点存在差异。
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| Fig 2 Curve of temperature change in ovariectomized rats administered with different concentrations of progesterone(x±s, n=6) |
| Group | △T/℃ | |||
| 6 h | 12 h | 18 h | 24 h | |
| Control | 0.08±0.11 | 0.09±0.13 | -0.05±0.08 | 0.07±0.16 |
| Solvent | 0.04±0.13 | -0.04±0.15 | 0.06±0.11 | 0.10±0.11 |
| Progesterone 1 mg·kg-1 | 0.13±0.12 | 0.18±0.12 | 0.01±0.16 | 0.01±0.18 |
| Progesterone 5 mg·kg-1 | 0.23±0.11* | 0.35±0.14** | 0.06±0.11 | 0.13±0.14 |
| Progesterone 25 mg·kg-1 | 0.38±0.12* | 0.45±0.14** | 0.07±0.14 | 0.08±0.13 |
| *P < 0.05, **P < 0.01 vs control | ||||
如Fig 3所示，♀大鼠进入动情后期体温开始明显升高，体温最高达(38.77±0.05)℃。然而，在PO/AH给予生理盐水或溶剂时，两组间动情后期体温变化无明显差异。通过前期实验发现，RN-1734在注射后第2 h发挥作用最明显，所以选择大鼠动情后期体温到达最高点前2 h，在PO/AH区给予RN-1734。通过阻断剂组与正常对照组和溶剂组比较，发现阻断剂组体温升高幅度明显降低，体温低至(38.23±0.06)℃，各个时间点的体温变化差值为大鼠动情后期体温升高的幅度(Tab 3)。从表中可看出，通过与动情期的体温进行对比，RN-1734组注射后的1~5 h，体温升高幅度明显降低。
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| Fig 3 Curve of temperature change on rats in metestrus after injecting specific antagonist RN-1734(x±s, n=6) |
| Group | △T/℃ | |||||
| 1 h | 2 h | 3 h | 4 h | 5 h | 6 h | |
| Control | 0.31±0.03 | 0.77±0.05 | 0.62±0.03 | 0.61±0.05 | 0.48±0.03 | 0.39±0.03 |
| Solvent | 0.26±0.04 | 0.72±0.03 | 0.63±0.04 | 0.59±0.03 | 0.51±0.04 | 0.44±0.05 |
| RN-1734 | 0.14±0.03** | 0.23±0.06** | 0.41±0.06* | 0.39±0.07* | 0.40±0.04* | 0.41±0.07 |
| *P < 0.05, **P < 0.01 vs control | ||||||
如Fig 4所示，去卵巢大鼠腹腔注射孕酮(5 mg·kg-1)12 h后，体温明显升高，达到高峰，体温最高达(39.58±0.08)℃。给予孕酮(5 mg·kg-1)后10 h，在PO/AH区给予RN-1734，体温升高幅度明显下降，体温为(39.10±0.10)℃。在未给予孕酮的去卵巢大鼠PO/AH区注射阻断剂RN-1734，体温升高幅度亦下降，但预先给予孕酮的去卵巢大鼠给予阻断剂后，体温下降较未给予孕酮的去卵巢大鼠更明显[12]。此外，Tab 4结果显示，在PO/AH区注射阻断剂RN-1734后，预先给予孕酮后12 h和14 h，大鼠体温升高幅度的下降较未给予孕酮(溶剂对照)的去卵巢大鼠明显(P < 0.05)。
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| Fig 4 Curve of body temperature change on ovariectomized rats administered with progesterone and/or specific antagonist RN-1734(x±s, n=6) |
| Time | △T/℃ | |||
| Control | RN-1734 | Progesterone | Progesterone+RN-1734 | |
| 2 h | 0.04±0.03 | 0.01±0.07 | -0.01±0.07 | 0.01±0.12 |
| 4 h | 0.31±0.06 | 0.35±0.04 | 0.37±0.07 | 0.35±0.07 |
| 6 h | 0.60±0.09 | 0.56±0.08 | 0.73±0.09* | 0.71±0.13 |
| 8 h | 0.79±0.09 | 0.88±0.06 | 0.86±0.11 | 0.88±0.10 |
| 10 h | 0.99±0.11 | 1.01±0.11 | 1.07±0.06 | 1.11±0.11 |
| 12 h | 1.18±0.10 | 0.94±0.11** | 1.43±0.08* | 0.96±0.11** |
| 14 h | 1.11±0.10 | 1.02±0.11 | 1.16±0.06 | 0.88±0.11** |
| 16 h | 0.85±0.09 | 0.77±0.07 | 0.86±0.10 | 0.84±0.06 |
| 18 h | 0.74±0.13 | 0.68±0.06 | 0.80±0.06 | 0.68±0.09 |
| 20 h | 0.56±0.04 | 0.54±0.03 | 0.60±0.08 | 0.57±0.09 |
| 22 h | 0.21±0.03 | 0.18±0.05 | 0.27±0.06 | 0.24±0.11 |
| 24 h | 0.04±0.07 | 0.01±0.07 | 0.10±0.05 | 0.12±0.05 |
| *P < 0.05, **P < 0.01 vs | ||||
机体的体温水平是影响新陈代谢活动的重要内在条件，体温过高会直接导致蛋白质变性、细胞膜结构破坏；而体温过低则影响代谢活动、兴奋的传导等生理功能反应。因此，体温作为基本的生命体征之一，维持其相对稳定至关重要。在育龄期女性，体温随月经周期的波动也具有其特定的生理意义，排卵前体温降低，为精子进入女性体内提供适宜的温度环境，而此后的体温升高则有利于受精卵的发育等生殖过程。一直以来，对于排卵后体温升高机制的认识还只限于明确了与孕激素水平有关，更详细的分子生物学机制还所知甚少。
TRPs蛋白家族的发现，对于多种感觉功能的生物学机制有了更深入的认识。其中，与温度感受有关的TRPs分子的相继被发现，提供了揭示机体体温调节的分子生物学机制的研究线索。作为TRPs蛋白家族成员之一的TRPV4在大多数哺乳动物及人体的多种组织细胞中均有表达，在成人背根神经节(dorsal root ganglia, DRG)，有关TRPV4通道的温敏特性的研究已取得了较多的成果[10]。TRPV4通道通过与多种物质结合发挥作用，其中包括微管结合蛋白、水通道蛋白-4、水通道蛋白-5、小窝蛋白-1等，使Ca2+浓度增加，进而调节生理功能活动。
目前已经证明，在PO/AH区体温调节中枢有TRPV4的表达，该通道蛋白的敏感温度为35 ℃以上。研究证明，正常体温条件下，阻断TRPV4可出现体温降低[11]。我们推测，育龄期女性基础体温在排卵后出现升高期，很可能与TRPV4的功能活动有关。为此，在本研究中，首先验证了在月经周期中大鼠体温的变化与孕酮水平的相关性，进而通过采用PO/AH区给予TRPV4特异性阻断剂RN-1734抑制TRPV4通道活性的方法[12-13]，观察了TRPV4对♀大鼠性周期体温波动的影响，结果可见给予特异性阻断剂后，大鼠动情后期体温升高的幅度明显降低。同时，我们还制备了去卵巢大鼠模型，观察不同浓度孕酮致大鼠呈现剂量依赖性体温升高的基础上，也观察到RN-1734能够降低孕酮致体温升高的幅度，进一步说明了孕酮致体温升高与TRPV4通道功能的关联性。
综上所述，在PO/AH区采用TRPV4通道特异性阻断剂RN-1734能够抑制孕酮致♀大鼠体温升高的作用，提示了体温调节中枢中的TRPV4通道可能参与了在动情后期孕酮致体温升高的过程，但相关的更详细的细胞内信号转导过程及细胞反应分子机制，还需要进一步深入研究。
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