褚克丹(1963-),女,教授,研究方向:中药学,通讯作者,E-mail:chukd5917@163.com
景天科植物红景天(Rhodiola rosea L.)是我国历史悠久的传统中药,具有益气活血、治疗胸痹心痛、中风偏瘫等功效。红景天苷是中药红景天的主要有效成分。课题组前期研究表明,红景天苷对大鼠大脑中动脉闭塞(middle cerebral artery occlusion, MCAO)模型具有神经保护作用[1-4]。在现阶段的研究中,在炎症反应中起重要作用的补体系统日益受到重视,受到过度激活的补体系统所产生的炎症效应片段,是造成脑内炎症反应损伤的主要始动因素之一[5]。来源于鼠肾上腺嗜铬细胞瘤的PC12细胞具有神经细胞的形态特征与功能,被广泛应用于神经系统疾病的研究。CoCl2是一种常用的化学性低氧模拟剂,在多种细胞中能诱导低氧诱导因子(hypoxia inducible factor,HIF)的表达,模拟缺氧状况,引起细胞缺氧、凋亡等相关反应[6]。本文主要研究红景天苷对化学低氧损伤PC12细胞中C3、Egr1、Egr4表达的影响,观察红景天苷是否能够逆转PC12细胞的神经损伤,探讨红景天苷神经保护作用的分子机制。
1 材料 1.1 细胞株PC12细胞,购自中国科学院上海生命科学研究院。
1.2 药品与试剂红景天苷由福建中医药大学提供,纯度≥98%;胎牛血清(HyClone,货号:SV 30087.02);Egr1(588)抗体(货号:sc-110)、Egr4(U-25)抗体(货号:sc-133540)、C3a受体拮抗剂(C3a receptor antagonist,C3aRA)(货号:SC-222291),均购自Santa Cruz公司;β-actin抗体(碧云天生物技术有限公司,货号:AA128);Egr4 siRNA(Qiagen,货号:SI01509025);caspase-3活性检测试剂盒(Cell Signaling Technology,货号:#5732S);DeadEndTM Fluorometric TUNEL System(美国Promega公司,货号:G3250);RNeasy® Mini Kit(QIAGEN,货号:74104、74106);RevertaidTM First Strand cDNA Synthesis Kit(Fermentas,货号:K1622);TaqMan® Universal PCR Master Mix(Applied Biosystems,货号:R11022)。
1.3 仪器7900HT荧光定量PCR仪(Applied Biosystems公司);Infinite M200 Pro多功能酶标仪(TECAN公司);ChemiDoc XRS+凝胶成像系统(Bio-Rad公司)。
2 方法 2.1 细胞培养PC12细胞接种在25 cm2细胞培养瓶中,加入含10%胎牛血清、1%青霉素、链霉素的改良型RPMI 1640培养液,置于37 ℃的细胞培养箱中培养、传代。
2.2 实验分组与处理待PC12细胞处于对数生长期后,将其分为5组:正常对照组(Normal)、模型组(Model)、CoCl2+0.1 μmol ·L-1红景天苷组、CoCl2 +1 μmol ·L-1红景天苷组、CoCl2+10 μmol ·L-1红景天苷组。待细胞长到80%后,吸出旧培养基,用PBS洗1遍,模型组和给药组中加入含CoCl2的培养基(CoCl2的终浓度为200 μmol·L-1)。之后给药组立即加入相应浓度的红景天苷,正常对照组加入相同的溶剂,细胞继续培养48 h,收集样品待测。
2.3 caspase-3活性的检测PC12细胞以2×108·L-1的密度接种于96孔板,每孔加入100 μL,待细胞长到80%后,PBS洗1遍,经CoCl2造模、红景天苷给药处理细胞48 h后,预冷的PBS漂洗1遍,加入25 μL试剂盒中的细胞裂解液,冰上静置5 min,再加入200 μL Ac-DEVD-AMC(caspase-3四肽荧光底物),于37 ℃避光孵育1 h后,在多功能酶标仪上测定荧光强度,激发波长380 nm,发射波长为420 nm,单位以相对荧光单位(relative fluorescence units,RFU)表示。
2.4 C3a受体拮抗剂实验实验分组:正常组(Normal)、正常+红景天苷(1 μmol·L-1)组、模型组(Model)、模型+红景天苷(1 μmol·L-1)组、模型+C3aRA(50 nmol·L-1)组、模型+C3aRA(50 nmol·L-1)+红景天苷(1 μmol·L-1)组。以2×108 ·L-1的细胞密度接种PC12细胞至24孔培养板中,每孔中加入不含抗生素的培养基0.5 mL,按照分组造模、给药后,细胞继续培养48 h后收集样品,检测Egr4、Egr1 mRNA表达及caspase-3活性。
2.5 Egr4 siRNA干扰实验实验分组:正常组(Normal)、模型组(Model)、siRNA阴性对照组(Negative control)、红景天苷组(Model+Salidroside组,红景天苷终浓度为1 μmol·L-1)、Egr4 siRNA组(Model+Egr4 siRNA组,Egr4 siRNA终浓度为50 nmol·L-1)、Egr4 siRNA+红景天苷组(Model+Egr4 siRNA+ Salidroside组,Egr4 siRNA终浓度为50 nmol·L-1,红景天苷终浓度为1 μmol·L-1)。转染前24 h,以2×108·L-1的细胞密度接种PC12细胞至24孔培养板中,每孔加入不含抗生素的培养基0.5 mL,使转染时的细胞密度能够达到30%~50%汇合度。按照分组造模给药,其中siRNA组加入siRNA-lipofectamineTM 2000(lipo2000)混合液混匀;作用6 h后,移去含有siRNA-lipo2000混合液的培养基,更换新鲜的培养基,且同时给予红景天苷(终浓度1 μmol·L-1),细胞继续培养48 h后收集样品,检测C3 mRNA表达,Egr4、Bax、Bcl-xl蛋白表达及caspase-3活性。
2.6 Western blot检测相关蛋白的表达提取细胞总蛋白,按照SDS-PAGE凝胶配制试剂盒说明书,配制合适浓度的分离胶。上样,电泳至蓝色带刚好跑到凝胶底部时终止电泳。转膜成功后TBS洗1遍,把PVDF膜浸泡在封闭液中,置于摇床上室温封闭2 h。加入一抗Egr1 (1 :800)、Egr4(1 :600)、C3(1 :600)、β-actin(1 :3 000),4 ℃孵育过夜。二抗室温孵育2 h,PVDF膜用TBS洗涤(10 min×3次),显影。
2.7 qPCR法检测相关基因的表达提取细胞总RNA,逆转录成cDNA,以cDNA为模板,荧光定量PCR检测各基因的表达。PCR引物由上海捷瑞生物工程有限公司合成,参照GenBank中大鼠Egr1、Egr4、C3的引物序列,Egr1引物上游序列5′-AAAATGGAATCTCTACGAAGGTCA-3′,下游序列5′-AGTCGCAGGTCAATGAAGAAGTC-3′,PCR扩增片断长度为128 bp;Egr4引物上游序列5′-AAGCTGGAGCAGGAAGAGGTTG-3′,下游序列5′-GCAGGGAGGAGGTTTTGGATAG-3′,PCR扩增片断长度为161 bp;C3引物上游序列5′-AAAATGGAATCTCTACGAAGGTCA-3′,下游序列5′-AGTCGCAGGTCAATGAAGAAGTC-3′,PCR扩增片断长度为128 bp。
2.8 统计学分析用SPSS 20.0统计软件进行统计学处理,所有结果用x±s表示。各组间数据比较采用单因素方差分析(One-way ANOVA),方差齐,采用LSD法,方差不齐,则采用Games-Howell法。
3 结果 3.1 红景天苷对PC12细胞低氧损伤后caspase-3活性的影响如Fig 1所示,200 μmol·L-1 CoCl2处理PC12细胞48 h后,与正常组比较,模型组中caspase-3活性明显升高;经不同浓度红景天苷处理后,细胞caspase-3活性明显下降,且呈剂量依赖性,10 μmol·L-1红景天苷作用的效果最好。
3.2 红景天苷对PC12细胞低氧损伤后C3蛋白表达的影响如Fig 2所示,与正常组比较,模型组中C3蛋白高表达,经不同浓度红景天苷作用后,C3蛋白表达降低,且随剂量的递增,条带的表达减弱。
3.3 红景天苷对PC12细胞低氧损伤后Egr4、Egr1蛋白表达的影响与正常组比较,模型组中Egr4、Egr1蛋白表达降低,经不同浓度红景天苷作用后,Egr4、Egr1蛋白表达增加(Fig 3)。
3.4 C3aRA对PC12细胞低氧损伤后caspase-3活性、Egr4、Egr1的影响PC12细胞低氧损伤模型经C3aRA作用后,caspase-3活性降低,Egr4、Egr1 mRNA表达增加,与红景天苷的作用没有明显差异(Tab 1)。这些结果表明,C3aRA对Egr4具有调控作用,进而对PC12细胞具有保护作用。
Group | Activity of Caspase-3 | Expression of Egr4 mRNA | Expression of Egr1 mRNA |
Normal | 1.00±0.06** | 1.00±0.10** | 1.00±0.07** |
Normal+Salidrosdie | 0.96±0.11** | 1.10±0.04** | 0.98±0.13** |
Model | 8.0±0.4 | 0.52±0.01 | 0.37±0.02 |
Model+Salidroside | 5.2±0.4** | 0.93±0.04** | 0.71±0.08** |
Model+C3aRA | 4.93±0.21** | 1.00±0.09** | 0.88±0.09** |
Model+C3aRA+Salidroside | 4.5±0.8** | 0.84±0.03** | 0.76±0.09** |
** P < 0.01 vs model |
siRNA干扰PC12细胞低氧损伤模型中Egr4的表达后,导致caspase-3活性升高,Bax蛋白增加,Bcl-xl蛋白降低;经红景天苷作用后,能逆转Egr4 siRNA所引起的基因表达的变化,但对C3没有作用(Fig 4、5)。这些结果表明,Egr4对C3没有调控作用,但红景天苷能够通过调控Egr4,进而对PC12细胞发挥保护作用。
4 讨论CoCl2诱导PC12细胞化学性低氧损伤模型,常用于神经细胞缺氧的体外研究。CoCl2能够诱导一些种类细胞里的HIF-1的表达,因此,可以作为PC12、HepG2等细胞株的化学性低氧模拟剂[7-8]。PC12细胞来源于鼠肾上腺嗜铬细胞瘤,具有神经细胞的形态特征与功能,广泛应用于神经系统疾病的研究[9-11]。CoCl2诱导的PC12化学低氧损伤模型能够模拟体内脑缺氧情况,是体外研究神经细胞缺氧的理想模型。本研究采用CoCl2诱导PC12化学性缺氧损伤发现,与正常组比较,模型组的Bax蛋白表达增加,Bcl-xl蛋白表达降低,caspase-3活性升高,经红景天苷作用后,能够逆转Bax、Bcl-xl蛋白的表达,以及caspase-3活性,表明红景天苷能抑制PC12细胞因低氧损伤而导致的细胞凋亡。
Egr4是与神经突触可塑性相关的基因,本研究发现,Egr4 siRNA作用后,Bax蛋白表达增加,Bcl-xl表达降低,caspase-3活性升高,经红景天苷作用后,能够逆转该作用。且研究发现,Egr4 siRNA对C3作用不明显。提示红景天苷能够促进Egr4的表达,进而抑制PC12细胞因低氧损伤而导致的细胞凋亡。
补体C3是激活补体系统4条途径的共同枢纽,在激活促炎因子、诱发炎症介质释放、溶解靶细胞中扮演关键的角色。活化后的补体C3在C3转化酶的作用下,在蛋白水平酶解成具有过敏性毒素的C3a小片段和C3b,C3a进而与C3a受体结合,发挥过敏性毒素的作用,导致细胞破坏、溶解[13-14]。本研究通过使用C3aRA阻断C3a/C3aR的结合。使用C3aRA后,PC12细胞的caspase-3活性降低,与红景天苷作用相似,提示红景天苷通过抑制补体C3/C3a受体,起到抗凋亡作用。且研究发现,拮抗C3a受体作用后,对Egr4具有调控作用。
综上所述,本研究结果提示,红景天苷对CoCl2诱导PC12细胞损伤模型具有神经保护作用,与抑制补体成分C3,促进Egrs表达,进而抑制Bax蛋白表达及caspase-3的活性,促进Bcl-xl表达有关。
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