阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease，AD)是一种发病过程漫长，多发生于中老年人，具有一定遗传性的神经退行性疾病。主要的临床表现为记忆力的减退以及认知功能的缺失[1-2]。关于AD的发病机制存在着多种假说，其中β淀粉样蛋白(amyloid β-protein, Aβ)沉积学说是当今的研究热点。β-分泌酶1(β-site APP cleaved enzyme-1, BACE-1)作为Aβ生成的限制酶，促进淀粉样前体蛋白(amyloid precursor protein，APP)水解成Aβ，间接控制着Aβ产生。BACE-1活性增强，Aβ生成增多，易导致Aβ异常聚集，沉积在脑内引起炎症等反应，造成神经元丢失、脑组织萎缩[3-4]。因此，抑制BACE-1表达，减少Aβ的生成，可以延缓AD的发生。
蛇床子素(osthole, OST)又名甲氧基欧芹酚(C15H16O3)，是伞形科植物独活中的活性单体[5]。现代药理学发现，OST具有广泛的药理作用，包括抗炎、抗凋亡、抗氧化应激等[5-7]。中医中，独活具有温肾壮阳、燥湿、祛风、杀虫等作用。实验室前期研究发现，OST可以调控miRNA-9，并且对神经系统具有一定的保护作用[8-10]。体内实验发现，以20 mg·kg-1 OST灌胃给予APP/PS1小鼠，对AD有一定的治疗作用[11]。
MicroRNAs (miRNAs)是一种调节内源性基因的非编码小RNA，它主要通过抑制mRNA的翻译或促进其降解而发挥作用[12]。近年来研究表明，AD的发生与多种miRNAs异常表达相关。现代药理学研究中，miRNAs可以作为诊断某种疾病的标志，并且miRNAs几乎可以调控人体内每一个生理过程[13]。本实验利用基因芯片技术，筛选差异表达的miRNA，并利用生物信息学预测miRNA调控的下游靶基因，探讨OST治疗AD的作用机制。
1 材料与方法 1.1 材料 1.1.1 实验动物与细胞株9月龄的APP/PS1双转基因小鼠20只，♀♂各半，体质量(26±4)g，购自北京中科泽晟生物技术有限公司[SCXK(京)2013-0002]；SPF级C57BL/6小鼠10只，♀♂各半，体质量(23±3)g，购于辽宁长生生物有限公司[SCXK(辽)：2010-0001]。293T细胞株、人神经母细胞瘤细胞株SH-SY5Y，均由首都医科大学提供。
1.1.2 试剂OST，购于中药食品药品研究所(批号：110822-200407)；APP595/596质粒、GFP质粒，以及辅助质粒pLP1、pLP2、pMDG，由天津医科大学提供；miRNA-9抑制剂，苏州吉玛基因股份有限公司产品；BACE-1引物，大连万泽生物技术有限责任公司产品；兔抗BACE-1、兔抗β-actin抗体，北京博奥森生物技术有限公司产品；DAPI染液，美国Sigma公司产品；Bradford法蛋白浓度试剂盒，江苏凯基生物技术股份有限公司产品。
1.1.3 仪器天平(德国赛多利斯艾科勒)；Ti-S型荧光显微镜(日本尼康公司)；二氧化碳培养箱(美国Nuaire公司)；MG96G PCR仪(杭州朗基科学仪器有限公司)；水平核酸电泳仪、半干式蛋白转膜仪(美国Bio-Rad公司)；凝胶成像系统(上海天能科技有限公司)、MR-96A酶标仪(深圳迈瑞公司)。
1.2 方法 1.2.1 基因芯片技术筛选差异表达miRNA取OST16 mg，溶解于2 mL PEG400中，加入ddH2O稀释至4 mL，4 ℃备用。9月龄APP/PS1小鼠，♀♂各半，将APP/PS1小鼠随机分为模型组(APP组)和给药组(OST组)，每组10只；另取C57BL/6小鼠作为空白对照组(Control)。给药组小鼠以20 mg·kg-1OST灌胃给药，每日两次，连续灌胃6周；对照组及模型组小鼠则以等剂量50% PEG400灌胃。
分别取模型组、OST组和空白组小鼠整脑，每组3只，提取总RNA，委托上海欧易生物医学科技有限公司，采用Agilent Mouse miRNA, Release 21.0芯片完成样本检测和分析。根据热图结果以及差异倍数变化值，进行差异miRNA筛选，筛选的标准为上调或者下调倍数变化值≥2.0，确定为OST调控较明显的miRNAs。
1.2.2 生物信息学预测miRNA调控靶基因利用TargetScan(http://www.targetscan.org/vert_70/)、PicTar(https://pictar.mdc-berlin.de/)、DIANA(http://diana.imis.athena-innovation.gr/DianaTools/index.php)3个miRNA靶点预测数据库，预测差异表达miRNA的下游靶基因，并利用Cytoscape关于miRNA的插件CytargetLinker验证(https://projects.bigcat.unimaas.nl/cytargetlinker/linksets/)。
1.2.3 APP高表达AD细胞模型的建立将APP595/596、GFP以及辅助质粒pLP1、pLP2、pMDG按照一定的比例[12]转染293T细胞；收集不同时间点的病毒液混合后，超滤管16 785×g离心1 h浓缩病毒液；将浓缩病毒液混合，并加入1%聚凝胺，转染人神经母细胞瘤SH-SY5Y细胞；用荧光倒置显微镜观察绿色荧光，转染3 d后，分别用RT-PCR和蛋白质印迹法检测APP mRNA及蛋白的表达量[12]。单纯GFP转染的正常SH-SY5Y细胞为空白对照组。
1.2.4 MTT法检测细胞活性将终浓度分别为25、50、75、100 μmol·L-1的OST分别加入APP高表达的SH-SY5Y细胞中，并设APP高表达的SH-SY5Y细胞为模型组，GFP转染的正常SH-SY5Y细胞为空白对照组。每组3个复孔，每孔中加入100 μL培养基，培养过夜，加入MTT试剂，避光培养4 h；弃去培养液，加入DMSO溶液，摇床震摇10 min，最后在酶标仪570 nm处测量吸光度。
1.2.5 RT-PCR检测miRNA-9和BACE-1 mRNA表达将5 μL miRNA-9抑制剂加入到45 μL基础培养基中，同时将5 μL脂质体2000加入到45 μL基础培养基，室温放置5 min，将两种混合物融合20 min后，加入到APP高表达的SH-SY5Y细胞中，即为抑制剂组；在此基础上，再加入终浓度为50 μmol·L-1的OST，即OST+抑制剂组。按照方法“1.2.4”设立OST组(50 μmol·L-1)、模型对照组和空白对照组。各组细胞内加入TRIzol提取RNA，稀释后测定各组RNA纯度，将RNA逆转录成cDNA后，-80 ℃保存。进行PCR扩增，按照以下比例配制PCR扩增体系：DreamTag PCR Master Mix 25 μL，上、下游引物各1.5 μL，样本cDNA 2 μL，水20 μL。反应条件如下：95 ℃ 2 min；95 ℃ 30 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，30个循环，72 ℃ 10 min。Image J进行光密度扫描。引物序列见Tab 1，miRNA-9引物由广州市锐博生物科技有限公司设计并合成，引物序列因涉及保密，不予公开。
| Gene | Sequence(5′-3′) | Product/bp |
| APP | F:AAAACGAAGTTGAGCCTGTTGAT | 350 |
| R: GAACCTGGTCGAGTGGTCAGT | ||
| BACE-1 | F: TGCAGTCCTGATGCCCCCGA | 300 |
| R: CATGGTGAGCCCGGGCCTTG | ||
| β-actin | F: TGC TGT CCC TGT ATG CCT CT | 385 |
| R: TTT GAT GTC ACG CAC GAT TT |
按照“1.2.5”设立分组，提取各组细胞蛋白，测定蛋白质浓度。各组蛋白上样量均为50 μg，SDS-PAGE电泳，转至PDVF膜(100 V，1 h)，脱脂奶粉TBST液封闭1 h，兔抗BACE-1 (1 :200) 4 ℃孵育过夜，TBST洗膜后，与HRP标记的二抗(1 :2 000)杂交，凝胶成像系统拍照保存，并用Image J定量测定信号强度。
1.2.7 统计学方法采用SPSS 13.0软件进行数据统计，GraphPad Prim 5.0软件绘制统计图。由箱线图判断数据是否符合正态分布。符合正态分布的计量数据以表示，多组之间的比较采用方差分析，两组间比较采用t检验。
2 结果 2.1 OST干预后差异表达miRNA筛选结果经过欧易生物进行各组小鼠脑组织样本芯片筛选，结果显示，模型组中上调的miRNAs有71个，下调的miRNAs 40个；而经过OST治疗后，与模型组性比，上调的miRNAs 25个，下调的miRNAs 53个，我们将差异倍数(fold change，FC)≥2作为筛选标准，其中miRNA-9差异倍数>2。热图结果显示(Fig 1)，miRNA-9在3组之间表达差异明显，可见miRNA-9是OST调控较明显的miRNA。
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Fig 1 MicroRNA differential expression demonstrated by clustering heat map
 High expression of miRNAs;  Low expression of miRNAs;  The expression of miRNAs was between that in APP group and control group.
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通过TargetScan、PicTar、DIANA三个数据库进行序列比对，发现miRNA-9可以与BACE-1靶向结合(Tab 2)，后续利用Cytoscape验证与BACE-1结合的miRNA有miRNA-9、miRNA-15b、miRNA-195等(Fig 2)。证明miRNA-9与BACE-1的靶向调控作用。
| Position 3079-3086 of BACE-1 3’-UTR | Sequence |
| BACE-1 | 5′…AGAAGUACUUCAUUAACCAAAGA… |
| mmu-miR-9 | 3′…AGUAUGUCGAUCUAUUGGUUUCU… |
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Fig 2 miRNA-9 binding to 3′-UTR of BACE-1 determined by bioinformatics
 BACE-1;  MicroRNA-9;  Other microRNAs bind to the 3′-UTR of BACE-1
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GFP慢病毒与带有GFP标记的APP慢病毒感染SH-SY5Y神经细胞，成功感染GFP慢病毒与带有GFP标记的APP慢病毒的SH-SY5Y具有绿色荧光(Fig 3A)。培养3 d后，经RT-PCR和Western blot验证，感染APP慢病毒的神经细胞具有APP基因和蛋白的高表达(Fig 3B、3C), 并且APP组中APP基因的表达是空白组(GFP组)的3倍，APP组中APP蛋白的表达是空白组的2倍, 说明成功建立APP过表达的AD细胞模型。
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| Fig 3 Establishment of AD cells with over expression of APP A:Green fluorescent picture of SH-SY5Y cells transfected with APP and GFP (scale bar=50μm); B:Expression of APP mRNA and protein in SH-SY5Y cells; C:The expression levels were semi-quantified by densitometric measurements (x±s, n=3). **P < 0.01 vs GFP group. |
Fig 4的MTT结果显示，OST对APP过表达SH-SY5Y细胞具有一定的保护作用。OST在50 μmol·L-1时，细胞的活力最高，而在75 μmol·L-1之后细胞活力呈下降趋势。因此，后续细胞的给药浓度选择50 μmol·L-1。
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| Fig 4 Effects of osthole on cell activity (x±s, n = 3) **P < 0.01 vs GFP group; ##P < 0.01 vs APP group |
将miRNA-9抑制剂转染到AD细胞模型中，以OST浓度50 μmol.L-1给药，建立抑制剂组、OST+抑制剂共处理组。RT-PCR结果显示(Fig 5)，与空白组相比，APP组中miRNA-9的表达明显降低，给予OST治疗后miRNA-9的表达相对模型组有所提高。BACE-1 mRNA在各组中的表达与miRNA-9的表达呈现负相关关系，模型组中BACE-1表达明显增多，OST可以降低BACE-1的表达，抑制剂组BACE-1表达最多，OST与抑制剂共处理组BACE-1表达介于抑制剂组和OST组之间。
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| Fig 5 Effects of osthole on expression of miR-9 and BACE-1 in cells (x±s, n = 3) **P < 0.01 vs GFP, ##P < 0.01 vs APP |
Fig 6的Western blot结果显示，与GFP组相比，APP组的BACE-1蛋白明显增多，给予OST治疗后，BACE-1蛋白表达相对APP组有所降低，而抑制剂组BACE-1蛋白表达最多，OST与抑制剂共处理组BACE-1蛋白表达介于OST组和抑制组之间。说明OST可以通过上调miRNA-9，抑制BACE-1蛋白的表达。
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| Fig 6 Expression of BACE-1 with osthole treatment in cells (x±s, n = 10) **P < 0.01 vs GFP; ##P < 0.01 vs APP |
AD是一种常见的严重影响人们生活质量的疾病，其特征为脑内积聚老年斑及神经原纤维缠结[13]，AD现已成为降低人类生活质量最严重的疾病之一。AD发生存在着多种假说，其中Aβ学说是当今的研究热点。正常人脑中Aβ的产生与降解会保持平衡，而BACE-1活性增强会加速对APP的裂解，从而大量生成Aβ，导致Aβ的沉积，产生神经毒性[14]，激活一系列病理改变，进而诱导神经细胞的凋亡。因此，减少脑内APP裂解，即抑制BACE-1活性，就可以达到治疗AD的作用。
本实验室前期研究表明，OST作为一种天然香豆素类化学成分，可以通过miRNAs直接调控下游靶基因，并且可以促进神经发生，改善APP/PS1小鼠脑区内学习认知能力[15]。本研究通过基因芯片技术，筛选OST干预APP/PS1小鼠后差异表达的miRNA-9，并且通过生物信息学分析，验证miRNA-9可以调控靶基因BACE-1的表达，将miRNA-9抑制剂转入APP高表达的AD细胞模型，发现模型组与对照组相比，BACE1蛋白的表达明显增高。给药后，BACE1蛋白表达相对模型组明显降低，抑制剂组BACE1蛋白表达最高，OST与抑制剂共处理组BACE1蛋白表达在给药组与抑制剂组之间，差异皆有统计学意义。说明OST可以通过上调miRNA-9，抑制BACE-1表达，从而达到治疗AD的作用。独活抗AD的分子机制比较复杂，调控miRNA-9的内在机制以及对其他miRNA的调控作用仍是未知，后续要通过大量实验研究，为独活应用于临床治疗AD提供依据。
综上所述，OST能够靶向调节miRNA-9，抑制BACE-1表达，从而达到治疗AD的作用，本研究为治疗AD相关新药研发提供了重要的实验依据。
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