2. 广西医科大学 药学院，广西 南宁 530021;
3. 广西医科大学 第一附属医院结直肠肛门外科，广西 南宁 530021;
4. 广西医科大学 广西生物医药协同创新中心，广西 南宁 530021
2. Pharmacy Dept, Guangxi Medical University, Nanning 530021, China;
3. Dept of Colorectal anal Surgery, the First Affiliated Hospital of Guangxi Medical University, Nanning 530021, China;
4. Guangxi Biomedical Collaborative Innovation Center; Nanning 530021, China
恶性肿瘤作为仅次于心血管疾病的第二大“隐形杀手”，现今已有取而代之的趋势。据估计，到2025年，全球新增肿瘤数量将达到2 000万，严重威胁人类健康和社会经济的可持续发展[1]。有数据显示，以胃癌、肝癌、食道癌为主的消化道肿瘤依然是位居中国前五的恶性肿瘤, 因此，胃癌仍是发病率和死亡率较高的恶性肿瘤之一，其5年生存率低于30%[2]，寻求新的途径来治疗胃癌尤为重要。迷迭香酸(rosmarinic acid，RA)是一种天然的水溶性苯酚羧酸，化学成分主要有酚类、萜类、黄酮类等。RA的药理作用也非常广泛，包括抗癌、抗菌、抗抑郁、保护神经等[3]。房祥杰等[4]报道，RA可通过MAPK/ERK信号通路，抑制结肠癌LS174T细胞增殖，诱导细胞凋亡。杨沛霖[5]报道，迷迭香酸类似物RA-C1能剂量依赖性地抑制人鼻咽癌CNE-1细胞增殖，并诱导其凋亡。从RA多种生物学效应的理论基础出发，本研究小组合成了十几个迷迭香酸类似物(rosmarinic acid analogue，RAA)。通过前期的药效学研究发现，迷迭香酸类似物-11(rosmarinic acid analogue-11，RAA-11)在抗肿瘤方面有明显优势，其化学结构式见Fig 1。因此，本课题进一步用RAA-11作用于人胃癌MGC-803细胞，基于表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor，EGFR)-JNK通路，探讨其对细胞增殖、迁移及凋亡的影响，为进一步开发RAA-11提供基础。
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| Fig 1 The chemical structure of RAA-11 |
RAA-11由广西医科大学药学院李清老师合成并鉴定(纯度≥98%)，用DMSO配制成50 mmol·L-1储存液，于-20 ℃避光保存，实验时用DMEM高糖培养基或RPMI 1640培养基稀释成低、中、高浓度(10、20、40 μmol·L-1)；RPMI 1640培养基、DMEM高糖培养基，购自美国Gibco公司；南美胎牛血清，购自依科赛生物科技(太仓)有限公司；0.25%胰蛋白酶-EDTA消化液(含酚红)、MTT、DMSO，购自北京索莱宝科技有限公司；AxyPrepTM Multisource Total RNA Miniprep Kit购自康宁生命科学(吴江)有限公司；RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit购自赛默飞世尔科技(中国)有限公司；SYBR® Premix Ex TaqTM Ⅱ(Tli RNaseH Plus)购自日本TaKaRa公司；EGFR mRNA、GAPDH mRNA引物，购自南京金斯瑞生物科技有限公司；EGFR、JNK、p-JNK、caspase-3、Bax、Bcl-2、GAPDH兔抗人单克隆抗体，购自沈阳万类生物科技有限公司。
1.2 仪器全自动酶标仪(美国伯腾仪器有限公司)；荧光倒置相差显微镜(日本尼康公司)；NanoDrop 2000分光光度计、StepOnePlusTM Real-Time PCR仪(赛默飞世尔科技有限公司)；电泳系统(美国Bio-Rad公司)；LI-COR Odyssey红外荧光扫描成像系统(美国LI-COR公司)。
2 方法 2.1 细胞培养人胃黏膜上皮细胞株GES-1和人胃癌细胞株MGC-803，购于中国科学院上海细胞库。GES-1细胞用含10%胎牛血清和1%青链霉素的DMEM高糖培养基常规培养，MGC-803细胞用含10%胎牛血清和1%青链霉素的RPMI 1640培养基常规培养，在含有5% CO2饱和湿度的37 ℃恒温箱中培养，长满后用0.25%胰酶消化用于后续实验。
2.2 MTT法常规培养人胃黏膜上皮GES-1细胞和人胃癌MGC-803细胞，收集处于对数生长期的细胞，将其密度调整为5×107·L-1，接种于96孔板，每孔100 μL。贴壁后，GES-1细胞加入200 μL用DMEM高糖培养基稀释的RAA-11(终浓度0、10、20、40、80、160 μmol·L-1)，MGC-803细胞加入200 μL用RPMI 1640培养基稀释的RAA-11(终浓度0、10、20、40、80、160 μmol·L-1)，每个浓度设置6个复孔。分别培养24、36、48 h后，每孔加入20 μL MTT，置孵箱中孵育4 h后，加100 μL DMSO并剧烈震荡10 min，用酶标仪测570 nm波长处各孔的OD值。细胞存活率 = OD加药组/OD对照组×100%。
2.3 划痕实验消化对数生长期的人胃癌MGC-803细胞，用RPMI 1640完全培养基将其密度调整为1.5×108·L-1，接种到6孔板，每孔2 mL。贴壁后弃培养基，用马克笔在6孔板背面划横线，小枪头在细胞上垂直于马克笔迹划竖线。用PBS洗下划掉的细胞，每孔分别加入2 mL用RPMI 1640培养基稀释的RAA-11(终浓度0、10、20、40 μmol·L-1)，拍照0、24、36、48 h划痕宽度(L)，计算细胞迁移情况。细胞迁移率 = (L0 h-Ln h)/L0 h×100%，n = 24、36、48。
2.4 荧光实时定量PCR(qRT-PCR)消化对数生长期的MGC-803细胞，接种于25 cm2培养瓶中，待其长到80%~90%左右，每瓶分别加入3 mL用RPMI 1640培养基稀释的RAA-11(终浓度0、10、20、40 μmol·L-1)。药物作用48 h后，收集细胞上清液，并消化贴壁细胞，按照试剂盒说明书提取MGC-803细胞总RNA，检测RNA浓度后置于-80 ℃保存。按照说明书进行逆转录，扩增。EGFR引物序列：Forward 5′-CCTGGTCTGGAAGTACGCAG-3′，Reverse 5′-CGATGGACGGGATCTTAGGC-3′；内参GAPDH引物序列：Forward 5′-GTCTTCACCACCATGGAGAAG-3′，Reverse 5′-GTTGTCATGGATGACCTTGGC-3′。实验结果通过相对定量方法分析，计算2-ΔΔCt值，比较组间基因表达水平是否具有统计学意义。
2.5 Western blot检测消化对数生长期的人胃癌MGC-803细胞，接种于25 cm2培养瓶中，待其长到80%~90%左右，每瓶分别加入用RPMI 1640培养基稀释的RAA-11(终浓度0、10、20、40 μmol·L-1)3 mL。药物作用48 h后，收集细胞上清液，并消化下贴壁细胞，加细胞裂解液(RIPA :PMSF :Cocktail = 100 :1 :1)于冰上裂解10 min，4 ℃、12 000 r·min-1离心30 min。上清液用BCA法测定蛋白浓度后，加上样缓存液煮沸变性10 min。取30 μg蛋白样品进行SDS-PAGE电泳，蛋白转移至PVDF膜上，TBST洗膜3次，5% BSA室温封闭30 min，一抗4 ℃孵育36 h。二抗室温避光孵育1 h，TBST避光洗膜3次后，于Odyssey红外荧光扫描成像系统上机扫膜，计算灰度值后分析数据。
2.6 数据处理经SPSS 20.0软件进行统计，实验结果用x±s表示，组间均数比较采用t检验，多组间的均数比较采用one-way ANOVA。所有实验均重复3次。
3 结果 3.1 RAA-11对GES-1细胞和MGC-803细胞增殖的抑制作用如Fig 2所示，与GES-1细胞相比，RAA-11能明显抑制MGC-803细胞的增殖，且呈时间浓度依赖性，提示RAA-11对MGC-803细胞有选择作用。线性回归得到RAA-11作用GES-1细胞24、36、48 h的IC50分别是289.425、220.430、189.521 μmol·L-1；作用MGC-803细胞24、36、48 h的IC50分别是72.781、59.979、40.625 μmol·L-1。
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| Fig 2 Effect of RAA-11 on survival rate at different concentrations at different time(x±s, n = 3) A:Human gastric mucosa cells GES-1; B:Human gastric cancer cells MGC-803. |
如Fig 3所示，实验各组在0 h时，划痕宽度基本接近(P＞0.05)。随着时间的推移(24、36、48 h)，与对照组相比，MGC-803细胞的迁移率随着RAA-11浓度增加明显降低(P < 0.01)，且呈时间浓度依赖性。提示RAA-11可抑制人胃癌MGC-803细胞的迁移能力。
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| Fig 3 Effect of RAA-11 on migration rate of human gastric cancer MGC-803 cells at different concentrations at different time(x±s, n = 3) **P < 0.01 vs 0 μmol·L-1 group |
如Fig 4所示，RAA-11作用于MGC-803细胞48 h后，与对照组相比，EGFR mRNA表达明显下调(P < 0.01)。结果提示RAA-11抑制MGC-803细胞的增殖和迁移可能与EGFR基因有关。
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| Fig 4 Effect of different concentrations of RAA-11 on expression level of EGFR mRNA in human gastric cancer MGC-803 cells(x±s, n = 3) **P < 0.01 vs 0 μmol·L-1 group |
如Fig 5所示，与对照组比较，RAA-11作用于MGC-803细胞48 h后，促凋亡蛋白caspase-3和Bax表达增加，同时抑凋亡蛋白Bcl-2表达明显降低，表明RAA-11可诱导MGC-803细胞的凋亡。
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| Fig 5 Effect of different concentrations of RAA-11 on expression of apoptosis related proteins in human gastric cancer MGC-803 cells(x±s, n = 3) **P < 0.01 vs 0 μmol·L-1 group |
如Fig 6所示，与对照组比较，RAA-11作用于MGC-803细胞48 h后，通路蛋白EGFR明显下调，JNK、p-JNK表达明显上升。提示RAA-11可能通过作用EGFR-JNK通路，抑制MGC-803细胞增殖和迁移，并诱导其凋亡。
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| Fig 6 Effect of different concentrations of RAA-11 on expression of EGFR-JNK pathway proteins in human gastric cancer MGC-803 cells(x±s, n = 3) **P < 0.01 vs 0 μmol·L-1 group |
与坏死不同，细胞凋亡(或称程序性细胞死亡)是细胞与生俱来的一种机制，借此机体可去除不需要的细胞[6]。caspases是细胞凋亡的重要介导因子，caspase-3作为caspases家族执行阶段的关键因子，在细胞凋亡过程中起着至关重要的作用，有研究证实，caspase-3在人肿瘤组织和细胞系中存在突变[7]。其下游因子Bcl-2是一种癌基因，可分为抗凋亡蛋白和促凋亡蛋白。在各种凋亡刺激下，促凋亡蛋白Bax通过诱导线粒体外膜通透性和释放凋亡所需的可溶性因子，触发内在凋亡通路[8]。本实验结果显示，RAA-11能够抑制抗凋亡蛋白Bcl-2的表达，同时促进凋亡启动因子caspase-3以及促凋亡蛋白Bax的表达，所以我们认为RAA-11可以诱导人胃癌MGC-803细胞凋亡。
EGFR又称ERBB1和HER1，是一种跨膜酪氨酸激酶受体。EGFR是人类表皮受体(HER)家族的一员，是细胞信号通路的重要组成部分[9]。研究表明，抑制EGFR信号通路可诱导癌细胞增殖、迁移和细胞衰老[10]，EGFR在肿瘤生长中起着至关重要的作用[11]。EGFR通常位于细胞膜表面，当受到某些刺激时，可以激活它位于细胞内的激酶通路，诱导其下游通路的磷酸化，包括MAPK、Akt、STAT3通路, 促进细胞生长、增殖。本实验结果显示，RAA-11从基因和蛋白水平均下调了EGFR的表达，表明RAA-11抑制MGC-803细胞的增殖和迁移，并诱导其凋亡与EGFR通路有关。
JNK是丝裂原活化蛋白激酶(MAPKs)家族的成员之一，其中JNK家族包括10个由3个基因编码的亚型:JNK1(4个亚型)、JNK2(4个亚型)和JNK3(2个亚型)。JNK1和JNK2存在于身体的所有细胞和组织中，而JNK3主要在心脏、大脑和睾丸中表达。众多研究表明，JNK在炎症、凋亡、坏死信号通路的调控中发挥重要作用[12]。JNK诱导MGC-803细胞凋亡可能是通过线粒体途径发挥作用，诱导细胞色素释放入细胞质内，既可促进多种凋亡蛋白的表达，又可作用于Bcl-2家族中促凋亡蛋白Bax、Bak等，从而启动细胞凋亡的途径[13]。本实验结果显示，RAA-11明显下调了通路蛋白EGFR的表达水平，并上调了通路蛋白JNK、p-JNK的表达量，我们猜想RAA-11可能通过EGFR-JNK通路来抑制人胃癌MGC-803细胞增殖和迁移，并诱导其凋亡。
综上所述，本实验表明RAA-11对人胃癌MGC-803细胞的增殖、迁移有明显的抑制作用，并能够诱导其凋亡，机制可能与EGFR-JNK通路有关。结合前期研究，我们认为RAA-11通过多条通路对人胃癌MGC-803细胞发挥抗肿瘤效应。
( 致谢: 本文实验在广西医科大学科技楼基础实验室完成，由衷感谢各位老师和同学的帮助！)
| [1] |
刘鹏, 杜秀婷, 韦海林, 等. 中国与美国恶性肿瘤的现状比较及差异分析[J]. 肿瘤预防与治疗, 2017, 30(4): 299-304. Liu P, Du X T, Wei H L, et al. Comparison and analysis of the current status of cancer in China and the United States[J]. J Cancer Control Treat, 2017, 30(4): 299-304. doi:10.3969/j.issn.1674-0904.2017.04.012 |
| [2] |
Beeharry M K, Liu W T, Yan M, et al. New blood markers detection technology:a leap in the diagnosis of gastric cancer[J]. World J Gastroenterol, 2016, 22(3): 1202-12. doi:10.3748/wjg.v22.i3.1202 |
| [3] |
娄诤, 赵肖涯, 杜丽君, 等. 迷迭香酸抑制人多发性骨髓瘤ARH-77细胞增殖的作用机制[J]. 中国药理学通报, 2018, 34(8): 1078-82. Lou Z, Zhao X Y, Du L J, et al. Mechanism of rosmarinic acid inhibiting proliferation of human multiple myeloma ARH-77 cells[J]. Chin Pharmacol Bull, 2018, 34(8): 1078-82. doi:10.3969/j.issn.1001-1978.2018.08.010 |
| [4] |
房祥杰, 张彬, 张德重, 等. 迷迭香酸通过MAPK/ERK信号通路对结肠癌细胞增殖及凋亡的影响[J]. 中国肿瘤, 2018, 27(4): 306-10. Fang X J, Zhang B, Zhang D Z, et al. Effects of rosmarinic acid on proliferation and apoptosis of colon cancer cells via MAPK/ERK signaling pathway[J]. China Cancer, 2018, 27(4): 306-10. |
| [5] |
杨沛霖.迷迭香酸类似物RA-C1通过依赖Caspase的线粒体通路抑制鼻咽癌CNE-1细胞增殖[D].南宁: 广西医科大学, 2018. Yang P L. RA-C1, an novel analogue of rosmarinic acid, suppresses cell proliferation of human nasopharyngeal carcinoma cells line CNE-1 through mitochondrion-dependent signaling pathway[D]. Nanning: Guangxi Medical University, 2018. |
| [6] |
Yamaguchi R, Lartigue L, Perkins G. Targeting Mcl-1 and other Bcl-2 family member proteins in cancer therapy[J]. Pharmacol Ther, 2018, pii:S0163-7258(18): 30193-1. |
| [7] |
Lin J, Zhang Y, Wang H, et al. Genetic polymorphisms in the apoptosis-associated gene CASP3 and the risk of lung cancer in Chinese population[J]. PLoS One, 2016, 11(10): e0164358. doi:10.1371/journal.pone.0164358 |
| [8] |
Reyna D E, Gavathiotis E. Self-regulation of BAX-induced cell death[J]. Oncotarget, 2016, 7(41): 66326-7. |
| [9] |
Wang S, Song Y, Yan F. Mechanisms of resistance to third-generation EGFR tyrosine kinase inhibitors[J]. Front Med, 2016, 10(4): 383-8. doi:10.1007/s11684-016-0488-1 |
| [10] |
Gray M E, Lee S, McDowell A L, 等. Dual targeting of EGFR and ERBB2 pathways produces a synergistic effect on cancer cell proliferation and migration in vitro[J]. Vet Comp Oncol, 2017, 15(3): 890-909. |
| [11] |
Sekine A, Katano T, Oda T, 等. Miliary lung metastases from non-small cell lung cancer with Exon 20 insertion:A dismal prognostic entity:A case report[J]. Mol Clin Oncol, 2018, 9(6): 673-6. |
| [12] |
Shvedova M, Anfinogenova Y, Atochina-Vasserman E N, 等. c-Jun N-terminal kinases (JNKs) in myocardial and cerebral ischemia/reperfusion injury[J]. Front Pharmacol, 2018, 9: 715. |
| [13] |
Takagi Y, Nozaki K, Sugmo T, 等. Phosphorylation of c-Jun NH(2) -terminal kinase and p38 mitogen-activated protein kinase after transient forebrain ischemia in mice[J]. Neurosci Lett, 2000, 294(2): 117-20. |