2. 广东医科大学 广东天然药物研究与开发重点实验室，广东 湛江 524023
2. Guangdong Key Lab for Research and Development of Natural Drugs, Guangdong Medical University, Zhanjiang Guangdong 524023, China
骨性关节炎(osteoarthritis, OA)是由创伤、肥胖、衰老、遗传等许多因素引起的关节软骨损伤退化、软骨下骨及关节增生的一种退行性病变[1]。据统计报道，肥胖和人口老龄化常常伴随着OA的产生，男性的患病率往往低于女性，OA影响着越来越多的人[2]。据预测，到2020年，OA将是40岁人群发病和身体局限的主要原因。如何防治OA，是人们亟待解决的难题。丹参是天然的传统中药，具有抗炎、抗菌、抗氧化等药理作用，特别是对心血管系统、神经系统有较强的药理活性，主要含有脂溶性成分丹参酮和水溶性成分丹参酚酸、丹参素等[3]。有研究表明，丹参酮防治OA可能是通过提高软骨细胞的活性，对抗氧自由基来防止软骨的破坏[4]。文献报道[5-6]，丹参注射液可以抑制体外兔软骨细胞凋亡，关节腔注射丹参注射液治疗OA，可以缓解膝关节软骨退变。丹参水提液(water extract of Danshen, DWE)是否可防治大鼠OA，尚未见报道。因此，本实验采用关节腔内注射碘乙酸钠(monosodium iodoacetate, MIA)建立大鼠OA模型，通过ELISA法、组织病理学、Micro-CT等技术，探讨DWE对MIA所致大鼠骨关节软骨退变的预防作用，为OA的治疗提供新的思路。
1 材料与方法 1.1 实验动物SPF级6月龄SD ♀大鼠27只，体质量(286±19)g，购自广西医科大学实验动物中心，合格证号：SCXK桂2014-0002。开始实验前适应性饲养1个月，实验时平均体质量为(295±22)g。每周称量体质量1次，且称量前1 d禁食、不禁水。
1.2 药物与试剂MIA(货号：305-53-3，批号：19148)，购自美国Sigma公司，避光称量120 mg MIA粉末于5 mL无菌EP管中，加入3 mL生理盐水，配成浓度为60 g·L-1 MIA溶液(造模前1 d配制，避光保存于4 ℃备用)。丹参购自黄冈金贵中药产业发展有限公司，批号：D7020305，将一定的丹参药材与单蒸水煎煮，浓缩成一定体积，以丹参素为含量计算，得到的DWE含丹参素浓度为1~1.2 g·L-1。基质金属蛋白酶13(matrix metalloproteinase 13, MMP-13)ELISA试剂盒，武汉伊莱瑞特生物科技股份有限公司；白介素6(interleukin 6, IL-6)ELISA试剂盒、肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor α, TNF-α)ELISA试剂盒，均购自杭州联科生物技术股份有限公司；改良番红O-固绿软骨染色液，索莱宝科技有限公司。
1.3 仪器石蜡切片机(德国Leica公司)；光学显微镜(日本Nikon公司)；viva Micro-CT 40(瑞士SCANCO Medical AG)；AE240电子天平(梅特勒·托利多仪器公司上海分公司)。
1.4 方法27只♀ SD大鼠随机分为3组，每组9只，分别为：假手术组(Sham)、MIA组、DWE组。Sham组在大鼠左侧膝关节腔内注入生理盐水50 μL，MIA与DWE组在大鼠左侧膝关节腔内注入MIA溶液50 μL[7]。注射MIA后d 2开始灌胃给药，Sham与MIA组给予生理盐水5 mL·kg-1，DWE组给予DWE 5 mL·kg-1。所有大鼠每天灌胃1次，连续给药6周，每周称体质量1次，并按大鼠体质量变化调整给药量。实验结束，麻醉后心脏采血处死，分离血清，-80 ℃保存备用。取左侧胫骨和股骨用10%中性甲醛固定12 h，换70%乙醇保存，备用。
1.5 血清相关指标的检测采用ELISA法检测血清中MMP-13、IL-6、TNF-α水平，具体方法按照试剂盒说明书操作。
1.6 Micro-CT检测扫描前，取胫骨浸泡于显影液中，水浴锅恒温(37 ℃)浸泡20 min进行扫描。扫描参数为：图像矩阵为2 048×2 048×223，整合时间为200 ms，能量/强度为45 kVp、177 μA、8 W，以1 200 mg HA/cm校正CT值，0角度旋转，进行扫描。扫描完成后，用Micro-CT自带软件对骨组织重组图像进行三维旋转，以确保横向轴与垂直轴对齐，进行定量分析内侧关节面软骨厚度时，选取以正中心前后各2.0 mm，共层厚4.0 mm的关节组织为测量区域(regional of interest, ROI)进行三维图像重组，以最低阈值为170提取图像信息。在对应的关节面ROI下对软骨以及软骨下骨小梁进行三维图像重组。可得到以下参数：软骨体积(cartilage volume)、软骨厚度(cartilage thickness)[8]。分析重建后的软骨体积和软骨厚度，可以反映软骨的破坏程度。软骨体积越小、厚度越薄，则表示软骨退化、结构破坏越严重。
1.7 番红O-固绿软骨染色检查将股骨脱钙、脱水、透明、石蜡包埋，4 μm厚度的组织切片备用。将股骨石蜡切片经过烤片、脱蜡、染色、封片，得到番红O-固绿染色组织片[9]。做OARSI(Osteoarthritis Research Society International, OARSI)病理学评分[10]。
1.8 统计学方法实验所有测定指标均采用x±s表示，用SPSS 17.0统计软件分析数据，各项指标采用单因素方差分析(One-Way ANOVA)进行检验，若方差齐性，采用Fisher signigicant difference(LSD)进行检验；若方差不齐，采用Tamhane′s T2(M)检验。作图软件为GraphPad Prime 6.0，对所有结果的数据作柱状图分析。
2 结果 2.1 各组大鼠一般状态和体质量变化在进行OA造模时，关节腔注射MIA的大鼠膝关节从进针处开始出现红斑，肿胀现象随时间逐渐蔓延到整个膝关节，关节出现红肿热痛，大鼠行动减少，左后肢屈缩、跛行，进食量下降，精神萎靡，体质量下降。注射生理盐水的大鼠起初会出现红斑，但数小时后红斑消退。1周后，大鼠精神状态和进食慢慢恢复，随着给药的进行，DWE组的肿胀程度较MIA组轻，活动较MIA组灵敏，Sham组大鼠膝关节无肿胀且活动灵敏。整个实验过程中，除了造模后的1周体质量有所下降，各组大鼠的体质量都有所增加，但是体质量差异无统计学意义(Tab 1)。
| Group | Body weight/g | ||||||
| 0 w | 1 w | 2 w | 3 w | 4 w | 5 w | 6 w | |
| Sham | 294±23 | 296±24 | 301±25 | 303±25 | 305±26 | 302±26 | 306±24 |
| MIA | 291±18 | 285±19 | 295±26 | 296±26 | 296±28 | 303±26 | 306±26 |
| DWE | 299±26 | 290±23 | 304±26 | 298±24 | 305±26 | 304±28 | 308±28 |
由Fig 1可见，与Sham组相比，MIA组血清MMP-13水平明显升高(P＜0.01)，IL-6和TNF-α有上升的趋势，但无统计学意义(P＞0.05)。与MIA组相比，DWE组的MMP-13水平明显降低(P＜0.05)，IL-6和TNF-α有降低的趋势，但无统计学意义(P＞0.05)。
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| Fig 1 Changes in serum biochemical parameters of rats in each group(x±s, n=8) **P < 0.01 vs sham group; #P < 0.05 vs MIA group |
由Fig 2可见，与Sham组相比，MIA组的软骨厚度和软骨体积均明显减小(P＜0.01)；与MIA组相比，DWE组的软骨厚度和软骨体积均明显增加(P＜0.01，P＜0.05)。
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| Fig 2 Changes of medial cartilage thickness in tibia and articular surface of rats in each group(x±s, n=6) **P < 0.01 vs sham group; #P < 0.05, ##P < 0.01 vs MIA group |
由胫骨内侧软骨Micro-CT的二维图与三维图可见(Fig 3)，与Sham组相比，MIA组软骨厚度明显变薄；与MIA组相比，DWE组的软骨厚度有所增厚。
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| Fig 3 Micro-CT 2D map and 3D map of medial cartilage thickness of each group |
番红O-固绿染色结果显示(Fig 4)，Sham组关节软骨无骨关节炎表现，表面完整、平滑，软骨细胞排列正常，数量正常，核染正常，软骨基质着色鲜红；MIA组关节面糜烂、缺损、变形，损伤占比超过50%，软骨结构消失，软骨层进行性丧失或者损坏，软骨细胞数量减少，排列紊乱，有簇集现象，软骨基质着色变浅；DWE组损伤占比在10%~25%之间，软骨表面稍不平整，局部出现软骨细胞簇集，细胞数量减少，基质着色变浅。将染色的组织片经过OARSI病理学评分，结果如Fig 5所示，与Sham组比较，MIA组大鼠股骨关节面软骨OARSI病理学评分明显提高(P＜0.01)；与MIA组比较，DWE组大鼠关节面软骨OARSI病理学评分明显降低(P＜0.01)。
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| Fig 4 Histopathological observation of femoral medial articular cartilage in each group(Safranine O-fixed green staining, ×200) A: Sham; B: MIA; C: DWE. |
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| Fig 5 OARSI score of femoral medial cartilage in each group(x±s, n=6) **P < 0.01 vs sham group; ##P < 0.01 vs MIA group |
随着人口老龄化问题的突出，OA已成为提高中老年人生活质量的一大障碍，因此，建立合适的动物模型来研究OA非常重要。本实验通过关节腔内注射MIA诱发OA模型，手术简单方便、造模时间短、造模稳定、受其他因素干扰少，且造成关节渐进性退变[11]。从大鼠胫骨关节面内侧软骨的Micro-CT结果可以看出，与Sham组相比，MIA组的软骨厚度明显变薄，软骨体积减少，提示关节腔内注射MIA可导致大鼠胫骨关节面软骨退化和结构破坏。从大鼠股骨关节面内侧软骨番红O-固绿染色的组织切片及病理学评分结果可以看出，MIA组关节面糜烂、缺损、变形，损伤占比超过50%，软骨结构消失，软骨层变薄，软骨细胞数量变少，排列紊乱，有簇集现象，软骨基质着色变浅。与Sham组相比，MIA组的OARSI病理学评分明显提高，提示关节腔内注射MIA可导致大鼠股骨关节面软骨退化和结构破坏。结果进一步说明，大鼠关节腔内注射MIA可以诱发OA。MIA能使软骨细胞凋亡、软骨基质降解，是一种甘油醛-3磷酸脱氢酶抑制剂[12]。在大鼠关节腔注射MIA后，会导致关节软骨出现损伤，出现软骨蛋白多糖基质的丢失和关节功能障碍等类似于人类OA发病时的症状[13]。MIA可能活化caspase-3来诱导大鼠软骨细胞凋亡[14]，但是其确切的机制尚未明确。
由大鼠胫骨关节面内侧软骨的Micro-CT结果可以看出，DWE组的软骨厚度和软骨体积均比MIA组明显增加，提示DWE可延缓MIA所致大鼠胫骨关节面的软骨退化和结构破坏。从大鼠股骨关节面内侧软骨番红O-固绿染色的组织切片及病理学评分结果可以看出，DWE组损伤占比在10%~25%之间，软骨表面稍不平整，局部出现软骨细胞簇集，细胞数量变少，基质着色变浅。此外，DWE组OARSI病理学评分明显比MIA组低，提示DWE可延缓MIA所致大鼠股骨关节面的软骨退化和结构破坏。结果进一步说明，DWE对MIA所致大鼠骨关节软骨退变有一定的保护作用。
由血清检测结果可见，DWE组的MMP-13水平比MIA组低，提示丹DWE延缓MIA所致大鼠骨关节软骨退化的作用可能与抑制MMP-13有关。文献报道，丹参注射液减轻软骨损伤可能是通过修正在OA软骨组织中MMP-9和TIMP-1的异常表达[5]，也可能是通过抑制软骨细胞线粒体调亡通路信号转导，进而抑制其凋亡[6]。但是DWE的确切作用机制，还有待于深入研究。丹参分为脂溶性和水溶性两大类成分，水溶性成分主要为酚酸类化合物，具有改善微循环、增强耐缺氧能力、保护脑组织缺血/再灌注损伤、抗炎、抗氧化等药理活性。此外，丹参水溶性成分还可通过抗氧化应激作用而调节骨代谢[15]。文献报道，氧化应激在MIA诱导大鼠软骨细胞凋亡过程中起着重要的上调作用[14]。DWE防治大鼠OA的作用是否与其抗氧化应激作用有关，还有待于深入研究。
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