肝纤维化是肝硬化、肝癌和肝功能衰竭的共同病理基础和必经阶段, 特征是肝内细胞外基质(extracellular matrix, ECM)过度沉积。肝星状细胞(hepatic stellate cell, HSC)是合成ECM的关键细胞, 因此抑制其增殖并诱导其凋亡是抗肝纤维化的关键[1]。细胞毒素(cytotoxin, CTX)是眼镜蛇毒的主要活性成分, 生物活性多样, 对多种细胞均具有细胞毒性[2], 在抗肿瘤研究中具有广阔的应用前景[3]。本研究以HL7702细胞为对照, 探索CTX-1对人肝星状细胞LX2的选择性抑制作用。
1 材料与方法 1.1 材料 1.1.1 细胞株人肝星状细胞株LX2, 由广西医科大学病理学教研室馈赠; 人正常肝细胞株HL7702, 由广西医科大学生化教研室馈赠。
1.1.2 主要试剂与仪器广西眼镜蛇毒冻干粉, 由广西医科大学蛇毒研究所提供; DEAE-Sepharose CL-6B填料(美国Pharmacia Biotech公司); Spehadex G-50填料(GE公司); Macro-prep High S预装柱(Bio-Rad公司); CCK-8试剂盒(日本同仁公司); Annexin V-APC/7-AAD凋亡试剂盒(联科生物公司)。ÄKTATMstart层析系统(GE公司); 酶标仪(Biotek公司); 流式细胞仪(BD公司)。
1.2 方法 1.2.1 眼镜蛇毒CTX-1的分离纯化称取1 g广西眼镜蛇毒粗毒冻干粉, 溶解, 离心, 过滤上清后, 经DEAE-Sepharose CL-6B阴离子交换柱、Spehadex G-50凝胶柱、Macro-prep High S阳离子交换柱分离纯化。取活性峰冻干粉, 采用SDS-PAGE电泳进行纯度鉴定, NanoLC-ES-I-MS/MS进行质谱鉴定。
1.2.2 CCK-8法检测细胞增殖抑制率将LX2、HL7702细胞都分为空白组和实验组(CTX-1浓度分别为0.5、1、2、4、8、16 mg·L-1), 采用CCK-8法检测各组细胞的增殖抑制率。抑制率=[(空白组OD值-实验组OD值)/(空白组OD值-培养基组OD值)]×100%。
1.2.3 流式细胞术检测细胞凋亡将LX2、HL7702细胞都分为空白组和实验组(CTX-1浓度分别为1、2、4 mg·L-1), 采用Annexin V-APC/7-AAD双染法检测各组细胞的凋亡情况。
1.3 统计学处理数据采用SPSS 20.0软件进行分析, 以x±s表示, 多组间均数比较采用单因素方差分析。
2 结果 2.1 CTX-1的分离纯化广西眼镜蛇毒粗毒冻干粉经三步层析, 分离所得活性峰经鉴定确定为电泳纯的CTX-1, 分子量为9.498 ku。
2.2 CTX-1选择性抑制LX2细胞增殖CCK-8结果显示(Tab 1), CTX-1对两种细胞的增殖有抑制作用, 呈剂量依赖性。CTX-1抑制LX2细胞增殖的最低有效浓度为0.5 mg·L-1(P﹤0.05);抑制HL7702细胞增殖的最低有效浓度为8 mg·L-1(P < 0.05)。CTX-1对LX2细胞有明显的抑制作用, 其IC50为2.50 mg·L-1, 而CTX-1对HL7702抑制作用较弱, IC50达到18.97 mg·L-1, 说明CTX-1在抑制细胞增殖方面具有选择性。
| Group | Concentration /mg·L-1 | Inhibitory rate of LX2 cells/% | Inhibitory rate of HL7702 cells/% |
| Control | - | 0 | 0 |
| CTX-1 | 0.5 | 7.15±0.57* | 3.18±0.69 |
| 1 | 9.93±0.71* | 6.12±0.82 | |
| 2 | 52.19±2.22* | 7.15±0.88 | |
| 4 | 66.35±0.39** | 8.67±1.58 | |
| 8 | 82.55±2.47** | 11.42±0.66* | |
| 16 | 87.32±0.98** | 43.77±3.21* | |
| *P < 0.05, **P < 0.01 vs control | |||
流式细胞术结果显示(Tab 2), CTX-1诱导LX2细胞凋亡的最小浓度为2 mg·L-1(P < 0.05);诱导HL7702细胞凋亡的最小浓度为4 mg·L-1(P < 0.05), 说明CTX-1诱导LX2细胞凋亡的作用更强。
| Group | Concentration /mg·L-1 | Apoptotic rate of LX2 cells/% | Apoptotic rate of HL7702 cells/% |
| Control | - | 3.42±0.44 | 4.73±0.84 |
| CTX-1 | 1 | 4.25±0.31 | 5.71±1.44 |
| 2 | 13.26±0.42* | 8.59±0.71 | |
| 4 | 35.97±0.90* | 17.35±4.48* | |
| *P < 0.05 vs control | |||
本研究利用层析法从广西眼镜蛇毒分离纯化得到电泳纯的CTX-1, 证实CTX-1对LX2细胞增殖抑制能力强于HL7702, 诱导LX2细胞凋亡的作用也更强, 而对HL7702影响较小。以上结果说明, CTX-1具有选择性杀伤LX2细胞的特性。本研究首次探讨CTX-1对LX2细胞的抑制作用, 为肝纤维化治疗提供实验依据。
| [1] |
蔡凤桃, 张学荣, 孙林, 等. 眼镜蛇毒NGF通过PI3K/Akt促人肝星状细胞凋亡的机制研究[J]. 中国药理学通报, 2018, 34(1): 23-7. Cai F T, Zhang X R, Sun L, et al. Effect of cobra venom NGF on inducing apoptosis of LX2 cells by inhibiting Akt signaling pathway and its mechanism[J]. Chin Pharmacol Bull, 2018, 34(1): 23-7. doi:10.3969/j.issn.1001-1978.2018.01.007 |
| [2] |
Dubovskii P V, Utkin Y N. Antiproliferative activity of cobra venom cytotoxins[J]. Curr Top Med Chem, 2015, 15(7): 638-48. doi:10.2174/1568026615666150217113011 |
| [3] |
王艳, 林礼务, 陈志奎, 等. 眼镜蛇毒细胞毒素对人肝癌细胞增殖抑制活性及作用机制的研究[J]. 中国药理学通报, 2011, 27(10): 1426-9. Wang Y, Lin L W, Chen Z K, et al. Growth inhibition activity of cytotoxin from cobra venoms on BEL-7404 cells and its mechanism[J]. Chin Pharmacol Bull, 2011, 27(10): 1426-9. doi:10.3969/j.issn.1001-1978.2011.10.022 |