随着社会的发展，环境污染的日益严峻，以及人类生活方式的改变，癌症已经成为威胁人类生命健康头号杀手。2018年，美国癌症协会统计表明，无论是新发率还是死亡率，男女排名前三的癌症分别是前列腺癌、肺癌、结直肠癌和乳腺癌、肺癌、结直肠癌[1]，无论男女，肺癌的新发率和死亡率都占据前二位。但是，现在临床上还没有一个方法或者药物能够治愈肺癌，目前临床上主要的措施是采取手术切除和放化疗的方法[2-3]。近来选择靶向治疗的患者越来越多，然而靶向治疗的费用昂贵，放化疗还是主要的选择，但是其最主要及最容易发生的一个副作用就是恶心、呕吐及过敏反应[4-5]，所以很多的临床医生会选择在化疗前给予患者托烷司琼、地塞米松(dexamethasone，Dex)等药物，以减轻放化疗的副作用发生[6]。很多研究都报道，Dex和紫杉醇会相互拮抗，诱导耐药性的产生，降低化疗效果[7-8]。本文将运用体外、体内相结合的方法，考察Dex联合紫杉醇对肺癌细胞A549、Calu-1的作用，寻求相互作用的可能机制，为临床用药提供参考。
1 材料 1.1 细胞株与实验动物肺癌细胞A549、Calu-1，购自中科院细胞库。BALB/c-nu ♂裸鼠18只，体质量(20±2) g，由北京维通利华实验动物有限责任公司提供，SCXK(沪)2017-0005。
1.2 药物与试剂紫杉醇、MTT，购自Sigma公司；DMEM高糖培养基、胎牛血清、Matrigel基质胶，购自Gibco公司；糖皮质激素受体(glucocorticoid receptor, GR)、P-糖蛋白(p-glycoprotein, P-gP)、多药耐药蛋白1(multidrug resistance protein 1, MRP-1)抗体，均购自CST公司。
1.3 仪器CO2细胞培养箱、高速低温离心机、多功能酶标仪(美国Thermo公司)；电热恒温水浴锅(上海精宏实验设备有限公司)；电子天平(德国Sartorius公司)；游标卡尺(桂林广陆数字测控股份有限公司)；流式细胞仪(BD公司)。
2 方法 2.1 细胞活力的测定A549、Calu-1细胞培养于DMEM高糖培养基中(含10%胎牛血清、1%双抗)。细胞培养于直径为10 mm培养皿中，5% CO2、37 ℃恒温培养箱中培养，细胞长至80%~90%汇合后进行实验。细胞消化后，以1×104个/孔细胞接种于48孔板中，待细胞过夜贴壁后，分别以紫杉醇(0、0.25、0.5、0.75、1 μmol·L-1)及Dex(10 μmol·L-1)联合紫杉醇(0、0.25、0.5、0.75、1 μmol·L-1)作用于细胞48 h，空白对照组仅含有培养基，细胞对照组仅含有细胞及培养基。然后加MTT(终浓度为0.5 g·L-1)作用4 h，弃上清，每孔加入400 μL的DMSO溶解结晶，然后酶标仪570 nm测吸光度(OD)。按照如下公式计算细胞存活率，细胞存活率%=(加药处理组OD均值-空白对照组OD均值)/(细胞对照组OD均值-空白对照组OD值)×100%。利用Graphpad Prism软件计算出药物的半数致死浓度(IC50)值。
2.2 细胞周期的测定由细胞活力结果知，Calu-1较A549受Dex的影响较明显，所以在后续的实验中选择Calu-1。将Calu-1细胞以2×108·L-1接种于6孔板中，每孔2 mL细胞悬液，于培养箱贴壁过夜后，实验分对照组、紫杉醇(2.5 μmol·L-1)组、紫杉醇(2.5 μmol·L-1)与Dex(10 μmol·L-1)联用组，每组2孔，药物处理48 h，收集每组细胞，加入1 mL预冷70%乙醇吹打均匀，4 ℃固定2 h，离心弃上清，每个EP管加入0.5 mL碘化丙啶染色液，37 ℃避光孵育0.5 h, 于流式细胞仪在激发波长488 nm处检测红色荧光，采用流式软件进行细胞细胞DNA含量分析。
2.3 Western blot检测GR、P-gP、MRP-1蛋白的表达将Calu-1 2×108·L-1接种于6孔板中，每孔2 mL细胞悬液，于培养箱贴壁过夜后，实验分组同“2.2”，药物处理48 h，除去培养基，加入2 mL PBS洗1遍，吸干PBS，加入蛋白裂解液60 μL，于冰上裂解10 min，刮刀收集蛋白裂解液，并于冰浴超声离心1次，BCA测蛋白浓度，按体积4 : 1加入5×loading buffer，于恒温金属浴100 ℃变性5 min，保存于-20 ℃冰箱。采用10% SDS-PAGE电泳，转膜，NC膜用5%的脱脂奶粉室温封闭1 h，TBST缓冲液快速洗膜3次，每次8 min，然后一抗4 ℃孵育过夜，TBST缓冲液快速洗膜3次，每次8 min，HRP偶联的相应二抗室温孵育1 h，TBST缓冲液快速洗膜3次，每次8 min，ECL显影液显影。
2.4 裸鼠移植瘤模型的建立取对数生长期的Calu-1细胞，用无血清DMEM培养基及Matrigel基质胶等体积混合液校准细胞浓度，在裸鼠右侧腹部皮下注射100 μL的Calu-1细胞悬液，含有1×106个细胞，实验流程图按照Fig 4A进行。定期观察小鼠的行为及肿瘤的形成、生长，游标卡尺测量其最长径和最短径，计算瘤体积(V)，V=(ab2)/2，a为长径，b为短径。
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| Fig 4 Effects of paclitaxel combined with Dex on transplanted tumor in nude mice(x±s, n=6) A: Flow chart of therapy scheme; B: The body wight changes with treatment; C: Tumor volume changes with treatment; D: The tumor weight of each group; E: The tumor figures of each group. #P < 0.05, ##P < 0.01 vs control; *P < 0.05, **P < 0.01 vs paclitaxel |
待裸鼠的瘤长径长至3~5 mm后，按照瘤体积大小，将裸鼠随机分为3组：对照组(生理盐水0.2 mL)、紫杉醇组(2 mg·kg-1)、联合用药组(紫杉醇2 mg·kg-1+Dex 5 mg·kg-1)，每周给药3次，每周测量小鼠体质重及肿瘤的大小，d 25处死动物，收集肿瘤组织。
2.6 统计学分析所有数据采用x±s表示。采用SPSS 19.0统计软件对数据进行统计分析，各组数据进行正态性和方差齐性检验，两组之间差异采用独立t检验。
3 结果 3.1 Dex降低紫杉醇对肺癌细胞A549、Calu-1的敏感性如Fig 1所示，与紫杉醇单独作用相比，紫杉醇和Dex(10 μmol·L-1)作用于细胞48 h，明显降低了紫杉醇对细胞的敏感性，使IC50明显提高(A549细胞：IC50由0.58 μmol·L-1提高到1.35 μmol·L-1；Calu-1细胞：IC50由1.10 μmol·L-1提高到2.10 μmol·L-1)。
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| Fig 1 Dex reduced susceptibility of paclitaxel to lung cancer cells A549(A) and Calu-1(B)(x±s, n=3) **P < 0.01 Paclitaxel+Dex vs Paclitaxel |
如Fig 2所示，紫杉醇单独作用于Calu-1细胞48 h，使细胞明显阻滞于G1期，当紫杉醇和Dex(10 μmol·L-1)作用于细胞48 h时，则阻滞效果要弱于紫杉醇单独作用。可见Dex和紫杉醇共同作用时会减弱紫杉醇的作用，可能与耐药性的产生有关。
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| Fig 2 Effects of paclitaxel combined with Dex on cell cycle(x±s, n=3) ##P < 0.01 vs control; **P < 0.01 vs paclitaxel |
如Fig 3所示，当紫杉醇和Dex(10 μmol·L-1)作用于细胞48 h时，GR表达明显增多。紫杉醇和Dex(10 μmol·L-1)作用于细胞48 h时，P-gP、MRP-1蛋白的表达明显高于其他组，很可能是Dex-GR信号激活，进而使P-gP、MRP-1蛋白表达升高，从而产生耐药性。
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| Fig 3 Effects of paclitaxel combined with Dex on multidrug resistance protein expression(x±s, n=3) **P < 0.01 vs paclitaxel |
如Fig 4所示，紫杉醇单独作用时可以明显减小肿瘤的体积、肿瘤的重量，显示明显的抗肿瘤作用。但是紫杉醇和Dex联用时，与紫杉醇单独作用相比，肿瘤的体积和重量明显增大，说明紫杉醇和Dex联用可能降低了紫杉醇的抗肿瘤作用，这可能与产生耐药性有关。
4 讨论紫杉醇是目前临床上肺癌、乳腺癌等癌症化疗选择的一线药物，它最主要的功能是影响细胞有丝分裂过程中微管的形成，从而引起细胞的死亡，广泛用于乳腺癌、肺癌患者的化疗中。在化疗过程中，紫杉醇产生的副作用及耐药性也得到越来越多的重视[9]。恶心、呕吐及过敏反应是其主要的副作用，临床上往往会在化疗的时候给予Dex来减少副作用。本研究主要从体内、体外实验，研究使用Dex联合其他化疗药物(如紫杉醇)对化疗效果的影响。
糖皮质激素(如Dex)在临床上常用于减轻肿瘤患者在放化疗过程中产生的恶心、呕吐及过敏反应，改善食欲，减轻骨痛，抑制水肿[10-12]。但是，最近的研究发现，糖皮质激素可能会导致很多的化疗药物在多种实体瘤中发生化疗抵抗，糖皮质激素抑制肝癌、食道癌、结直肠癌、膀胱癌细胞的凋亡[13]。在本研究中，我们也证实了Dex可能会导致紫杉醇对肺癌细胞发生抵抗，但是具体的作用机制不清楚。
糖皮质激素是由肾上腺皮质分泌的类固醇激素，包括皮质醇和皮质酮，GR是典型的激素依赖型受体，是核受体的重要成员，当Dex作用于细胞时，会与GR结合。有研究表明，Dex会上调Krüppel样因子5(Krüppel-like factor 5, KLF5)的表达，而促进化疗耐药[14]。Dex-GR信号轴对化疗耐药起到关键作用，有研究表明，阻断Dex-GR信号能够减轻化疗抵抗[15]。P-gP、MRP-1是耐药性产生的两个关键蛋白，本研究也观察到Dex能使P-gP、MRP-1表达增多，进而产生耐药性，这在体内实验也得到相似的结果。提示Dex-GR信号轴激活使P-gP、MRP-1表达增多致使耐药性的产生可能为其机制之一。
综上，体内、体外实验都观察到Dex联合紫杉醇使肺癌细胞敏感性降低，产生耐药，使紫杉醇的化疗效果较低。因此，在临床上选择紫杉醇作为化疗药物时，应慎重选择Dex，或者考虑其他药物来减轻副作用。
( 致谢：本实验在上海中医药大学附属普陀医院中心实验室完成，在此感谢高月锦老师在实验中给予的帮助与支持 )
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