2. 四川大学生物治疗国家重点实验室，四川 成都 610064
2. State Key Lab of Biotherapy of Sichuan University, Chengdu 610064, China
荆芥为唇形科一年生草本植物荆芥(Schizonepeta tenuifolia Briq.)的干燥地上部分，是临床常用解表药，其味辛性平而偏寒，具有良好的祛风解表功效，临床上常用于治疗与风邪有关的表证及皮肤、头目疾患，而这些疾病都与炎症的病理过程相关。荆芥挥发油(essential oils of Schizonepeta tenuifolia Briq., EOST)含量丰富，是其辛味药性的物质基础之一[1]。实验室前期研究表明，EOST预防给药能通过下调促炎因子的释放，减轻炎性细胞浸润等，抑制炎症反应，从而发挥对内毒素中毒模型小鼠的保护作用，但其抗炎效应的分子机制有待进一步研究[2]。本研究基于前期药效研究基础，从NLRP3炎症小体激活角度，探讨EOST对内毒素中毒模型小鼠保护作用的抗炎效应机制，以期进一步揭示其抗炎作用机制，为EOST治疗“表证”的临床应用提供科学依据。
1 材料 1.1 实验动物♂C57BL/6J小鼠(动物合格证号11400700130007)，体质量(20±2)g，SPF级，购自北京维通利华实验动物有限公司，许可证号：SCXK(京)2012-0001。
1.2 药物与试剂荆芥，购自成都新荷花池中药材市场，经成都中医药大学中药鉴定教研室严铸云教授鉴定，为唇形科一年生草本植物荆芥(Schizonepeta tenuifolia Briq.)的地上部分。EOST的制备同文献[2]，实验时用0.35%吐温-80(Tween-80)配制药物，给药剂量分别为其半数致死量(LD50)的1/10和1/5，即0.226、0.452 g·kg-1。地塞米松、脂多糖(lipopolysaccharides from Escherichia coil 055:B5, LPS)，均购自美国Sigma公司; NO试剂盒，购自碧云天生物技术研究所; FastQuant cDNA第一链合成试剂盒、SuperReal PreMix Plus(SYBR Green)，均购自天根生化科技(北京)有限公司；AxyPrepTM Multisource Total RNA Miniprep Kit, 购自Axygen公司；抗组织蛋白酶(Cathepsin)B、嘌呤受体P2X7(purinergic 2X7 receptor, P2X7R)、GADPH、COP1抗体，均购自美国Abcam公司；抗NLRP3、pro-IL-1β抗体，均购自美国Cell Signaling公司；生物素化山羊抗兔IgG(H+L)、辣根酶标记链霉素卵蛋白素(HRP/A-V)、浓缩型DAB试剂盒，均购自北京中杉金桥生物技术有限公司；凋亡相关的斑点样蛋白(apoptosis-associated speck-like protein containing a CARD, ASC)抗体，购自Abbexa; caspase-1(p20)抗体，购自Santa Cruz公司；引物均由Invitrogen公司设计。
1.3 仪器酶标仪、NanoDrop 2000(美国Thermo Fisher Scientific公司)；PCR仪、凝胶成像系统、转膜仪(美国Bio-Rad公司)；2015型轮转式切片机(德国徕卡公司)；TSJ-Ⅱ型组织脱水机(常州市中威电子仪器有限公司)；BA200Digital数码三目摄像显微摄像系统(麦克奥迪实业集团有限公司)。
2 方法 2.1 实验分组、给药与造模取健康C57BL/6J♂小鼠，按体质量分层，随机分为空白组、模型组、地塞米松(0.005 g·kg-1)组、EOST(0.226、0.452 g·kg-1)组。除地塞米松组在d 4、5腹腔注射给药2次外，其余给药组小鼠按20 mL·kg-1体积灌胃给药，空白组与模型组给予等体积0.35%吐温-80溶液，连续给药5 d。末次给药后30 min，小鼠腹腔注射LPS (0.015 g·kg-1，10 mL·kg-1)造模，造模后12 h剖取小鼠肺组织，将右肺置于-80℃保存，左肺置于体积分数为10%的中性福尔马林溶液中，用于免疫组化实验。
2.2 小鼠肺组织中NO含量的检测按试剂盒说明书制备肺组织匀浆，采用Griess法进行NO含量测定。
2.3 小鼠肺组织NLRP3、ASC、caspase-1、IL-1β、iNOS、p65 mRNA的检测取“2.1”项下所得右肺组织于冰上解冻后，按照Axygen总RNA小量制备试剂盒步骤提取总RNA，测定总RNA纯度和浓度，并检测所得总RNA样本的完整性(琼脂糖凝胶)。逆转录合成cDNA，qPCR分析NLRP3、ASC、caspase-1、IL-1β、iNOS、p65 mRNA的表达。采用相对定量法，以GADPH基因为内参基因，以样本的平均Ct值作为校正值，通过差异值反映EOST对模型小鼠肺组织NLRP3、ASC、caspase-1、IL-1β、iNOS、p65 mRNA表达的影响。引物序列见Tab 1。
| Gene | Primer sequence | Product length/bp |
| NLRP3 | F 5’- AGGAGGAAGAAGAAGAGAGGA-3′ | 132 |
| R 5′- AGAGACCACGGCAGAAGC-3′ | ||
| ASC | F 5′-ACTCATTGCCAGGGTCACAGAAGTG-3′ | 122 |
| R 5′-GCTTCCTCATCTTGTCTTGGCTGGT-3′ | ||
| caspase-1 | F 5′-CGTCTTGCCCTCATTATCTG-3′ | 160 |
| R 5′-TCACCTCTTTCACCATCTCC-3′ | ||
| IL-1β | F 5′-TGTAATGAAAGACGGCACACC-3′ | 68 |
| R 5′-TCTTCTTTGGGTATTGCTTGG-3′ | ||
| iNOS | F 5′-CAGCTGGGCTGTACAAACCTT-3′ | 95 |
| R 5′-CATTGGAAGTGAAGCGTTTCG-3′ | ||
| p65 | F 5′-CTTGGCAACAGCACAGACC-3′ | 266 |
| R 5′-GAGAAGTCCATGTCCGCAAT-3′ | ||
| GADPH | F 5′-TGGCCTTCCGTGTTCCTAC-3′ | 178 |
| R 5′-GAGTTGCTGTTGAAGTCGCA-3′ |
将“2.1”项下所得左肺组织石蜡切片常规脱蜡至水，热抗原修复和山羊血清封闭后，用一抗、二抗孵化，DAB显色，苏木精复染，脱水，透明，中性树胶封片。采集图像，细胞膜或细胞质内出现浅黄色或棕色的颗粒物质为阳性表达。采用Image-Pro Plus 6.0图像分析系统，测定所采集全部图像的平均光密度(平均光密度=黄色或棕色部分的累积光密度值/照片面积)。
2.5 Western blot检测小鼠肺组织NLRP3、caspase-1(p20)、pro-IL-1β、COP1蛋白表达取各组小鼠右肺组织40 mg，加入液氮制成粉末状，再加入400 μL RIPA裂解液制备匀浆，4℃、10000 r·min-1离心5 min，取上清，釆用BCA法测定蛋白含量，将所有蛋白样本调至等浓度。取低温保存的蛋白样品，95 ℃水浴加热5 min后，上样电泳。采用湿法转膜，转膜后的PVDF膜用封闭液(5%脱脂牛奶)封闭2 h，加入一抗孵育过夜，漂洗后，加入二抗孵育1.5 h。显色液显色后测定灰度值，运用Image lab图像分析系统测定光密度值，目的蛋白条带灰度值/内参蛋白条带灰度值即为蛋白相对含量，进行统计分析。
2.6 统计学方法采用SPSS 21.0统计软件进行分析，计量资料以x±s表示，组间比较采用独立样本t检验。
3 结果 3.1 EOST对LPS中毒模型小鼠肺组织NO含量的影响如Tab 2所示，模型组小鼠NO含量较空白对照组明显升高(P < 0.05)；EOST 0.452 g·kg-1剂量组小鼠肺组织NO含量较模型组明显降低(P < 0.05)。
| Group | NO/μmol·L-1 |
| Control | 92.59±30.58 |
| Model | 124.71±19.21# |
| DEX | 98.64±37.93 |
| EOST 0.226 g·kg-1 | 100.43±33.52 |
| EOST 0.452 g·kg-1 | 99.90±23.04* |
| #P < 0.05 vs control; *P < 0.05 vs model | |
Tab 3所示，与空白组比较，模型组小鼠肺组织中NLRP3、caspase-1、iNOS、p65、IL-1β mRNA表达水平明显升高(P < 0.01，P < 0.05)，提示NLRP3炎症小体被激活。与模型组比较，EOST 0.452 g·kg-1明显降低小鼠肺组织中NLRP3、iNOS、p65、IL-1β mRNA的表达(P < 0.01，P < 0.05)。
| Group | Relative mRNA expression | |||||
| NLRP3 | ASC | Caspase-1 | IL-1β | iNOS | p65 | |
| Control | 0.85±0.42 | 1.02±0.24 | 1.08±0.14 | 1.14±0.55 | 1.45±0.38 | 0.93±0.17 |
| Model | 6.67±1.67## | 1.32±0.77 | 2.94±0.79# | 46.44±8.21## | 14.08±3.15## | 1.27±0.15## |
| DEX | 8.85±2.42 | 3.32±0.74** | 6.96±1.62** | 46.71±13.56 | 16.69±3.88 | 1.32±0.11 |
| EOST 0.226 g·kg-1 | 5.02±4.29 | 1.95±0.63 | 3.03±1.30 | 39.88±15.89 | 10.53±1.93 | 1.34±0.26 |
| EOST 0.452 g·kg-1 | 3.7±1.20** | 2.24±0.50 | 2.91±1.48 | 22.58±9.27** | 5.71±2.01** | 1.05±0.09* |
| #P < 0.05, ##P < 0.01 vs control; *P < 0.05, **P < 0.01 vs model | ||||||
由Fig 1可知，与空白组相比，模型组小鼠肺组织Cathepsin B、P2X7R蛋白表达水平明显升高(P < 0.01)。与模型组比较，EOST 0.226 g·kg-1明显降低模型小鼠肺组织Cathepsin B蛋白含量(P < 0.01)，EOST 0.452 g·kg-1明显降低小鼠肺组织中P2X7R蛋白含量(P < 0.05)。
|
| Fig 1 Effect of EOST on protein expressions of Cathepsin B and P2X7R in lung tissues of inflammatory mice induced by endotoxin A: Cathepsin B or P2X7R SP staining in lung tissues of inflammatory mice induced by endotoxin (IHC×400); B: Optical density of cathepsin B and P2X7R in lung tissues of inflammatory mice induced by endotoxin (x±s, n=5). ##P < 0.01 vs control; *P < 0.05, **P < 0.01 vs model. |
如Fig 2所示，与空白组比较，模型组小鼠肺组织中NLRP3、p20、pro-IL-1β蛋白表达量明显上升(P < 0.01，P < 0.05)，COP1蛋白表达明显降低(P < 0.05)。与模型组比较，EOST(0.226、0.452 g·kg-1)能明显下调p20蛋白水平(P < 0.01，P < 0.05)，二者亦能明显升高COP1蛋白水平(P < 0.01，P < 0.05)；EOST 0.226 g·kg-1明显下调NLRP3蛋白表达水平(P < 0.05)。
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| Fig 2 Effect of EOST on expressions of NLRP3, caspase-1(p20), pro-IL-1β, COP1 protein in lung tissues of inflammatory mice induced by endotoxin (x±s, n=4) #P < 0.05, ##P < 0.01 vs control; *P < 0.05, **P < 0.01 vs model |
病原微生物的感染是“表证”的一个主要病因，炎症反应是“表证”的一个主要病理环节，解表药的解表功效与其抗炎作用密切相关。由于肺为“娇脏”，易受外邪入侵，且“肺主皮毛”，然“皮毛”为一身之表，有抵御外邪之功能，是人体抵抗外邪的屏障。LPS是革兰阴性菌细胞壁的重要成分，作为细菌分泌的内毒素，是导致炎症反应发生的重要原因。本研究选择LPS腹腔注射诱导的内毒素中毒模型小鼠，基于前期药效学的研究基础[2]，以NLRP3炎症小体通路为切入点，探讨EOST对内毒素中毒模型小鼠保护作用的抗炎效应分子机制，为荆芥“解表祛邪”功效的科学内涵阐释提供更为丰富的科学依据。
机体在受到革兰阴性细菌感染时，LPS作用于细胞膜受体，可导致大量炎性细胞因子和炎性介质的产生。NO是内毒素中毒机体产生的一种重要活性物质，其参与炎症反应，作用复杂，在不同类型的炎症反应和炎症阶段发挥着抗炎或者促炎的作用。体内NO由一氧化氮合酶(nitric oxide synthase, NOS)催化L-精氨酸产生，NOS包括结构型一氧化氮合酶(constitutive NOS, cNOS)和诱导型一氧化氮合酶(inducible NOS, iNOS)，cNOS可源源不断地产生，而iNOS只有在受到感染或其他刺激时才产生[3]。炎症反应中，经LPS和细胞因子刺激后，会生成iNOS，从而合成大量NO[4]。在高浓度条件下，NO激活NF-κB，诱导促炎症细胞因子TNF-α、IL-1β等的产生，TNF-α的产生又可激活iNOS，促进机体产生更多的NO，从而形成正反馈循环，使炎症细胞因子的分泌及NO自身的表达得以持续，致使炎症反应更持久、剧烈[5]。文献表明，薄荷酮抗炎作用的发挥可能通过影响NO的释放，来干扰NLRP3炎症小体的激活[6]。本研究发现，由LPS引起的中毒模型小鼠肺组织中NO的水平和iNOS基因的转录水平均明显升高，表明小鼠处于炎症病理状态。EOST能减少模型小鼠肺组织中NO水平，下调iNOS mRNA表达水平，进一步验证表明该挥发油对内毒素中毒模型小鼠有抗炎保护作用。
NLRP3炎症小体由核心蛋白NLRP3、接头蛋白ASC和效应蛋白caspase-1组成，能被一些内源性危险信号和外源性因素所激活，包括活性氧(reactive oxygen species, ROS)、LPS等[7-8]。NLRP3炎症小体受到这些激活剂刺激后，效应蛋白caspase-1会负责将无活性的前炎症因子Pro-IL-18和Pro-IL-1β剪切为成熟的IL-18和IL-1β，从而激活下游相关信号通路，生成大量的炎症介质，诱导机体发生严重的炎症反应。本研究发现，小鼠经内毒素攻击后，其肺组织中NLRP3、caspase-1、IL-1β mRNA表达明显升高，肺组织NLRP3、caspase-1(p20)和Pro-IL-1β蛋白表达亦明显增加，表明该模型小鼠肺组织中NLRP3炎症小体信号通路被激活，而EOST预防性给药，可明显下调模型小鼠肺组织中NLRP3、IL-1β mRNA和NLRP3、caspase-1(p20)蛋白表达水平，提示EOST对NLRP3炎症小体信号通路的激活具有抑制作用。
NLRP3炎症小体上游通路较为复杂，其激活的机制也不尽相同。其中，P2X7R是ATP门控离子通道，参与了机体免疫反应。K+外流是NLRP3炎症小体活化的关键环节，细胞内的K+可通过P2X7R外流，进而激活NLRP3炎症小体信号通路[9]。受到ATP刺激后，溶酶体被破坏，释放的Cathepsin B等多种溶酶体水解酶可介导NLRP3炎症小体的激活[10]。p65作为NF-κB信号通路激活的标志性蛋白，p65 mRNA的表达增加则表明NF-κB信号通路处于激活状态，调控NF-κB的活性能间接影响NLRP3炎症小体的激活[11]。只含CARD结构域蛋白COP1在炎症小体调控中发挥重要作用，COP1含有1个与caspase-1相似的CARD结构域，所以COP1可以通过竞争caspase-1，干扰炎症小体的组装，从而负向调控NLRP3炎症小体活化[12]。本实验结果显示，模型组小鼠肺组织P2X7R、Cathepsin B蛋白表达明显升高，p65、caspase-1 mRNA表达明显增高，COP1蛋白表达明显降低，表明该模型小鼠肺组织NLRP3炎症小体激活，其激活机制涉及多条上游信号通路。EOST预防性给药，能明显下调模型小鼠肺组织中P2X7、Cathepsin B蛋白，以及p65、caspase-1 mRNA的表达，明显上调COP-1蛋白表达，提示EOST抑制NLRP3炎症小体的激活是其抗炎作用机制之一，可能通过影响K+/P2X7R、溶酶体/Cathepsin B、NF-κB、COP-1/caspase-1等多种途径，发挥抑制效应。
综上，LPS所诱导的中毒模型小鼠体内NLRP3炎症小体信号通路呈现激活状态，EOST对内毒素中毒模型小鼠有抗炎保护效应，且EOST抑制NLRP3炎症小体的激活是通过干扰K+/P2X7R、溶酶体/Cathepsin B、NF-κB、COP-1/caspase-1等多途径发挥作用的，但对于炎症小体激活后其聚合体之间关系的变化尚不明晰，有待进一步深入。
( 致谢：本研究在成都中医药大学中药材标准化教育部重点实验室及国家中医药管理局中药药理科研三级实验室完成，感谢课题组成员在本研究过程中提供的帮助和指导！)
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