Bcl-2家族蛋白是线粒体凋亡途径重要的调控者，其中抗凋亡蛋白包括B细胞淋巴瘤-2(B-cell lymphoma，Bcl-2)、B细胞淋巴瘤超大蛋白(B-cell lymphoma extra large，Bcl-xL)、髓样细胞白血病-1(myeloid cell leukemia-1，Mcl-1)、Bcl-w和A1。近年来的研究发现，抗凋亡蛋白高表达是肿瘤细胞生存及耐药的重要机制之一，因此，抑制抗凋亡蛋白能达到杀伤肿瘤细胞的目的。“BH3-only”蛋白是天然的抗凋亡蛋白的抑制剂，但很难通过现有技术直接得到，因此，人们用模拟“BH3-only”蛋白的小分子化合物来抑制抗凋亡蛋白，由此诞生了BH3类似物(BH3 mimetics)的概念。自2005年以来，BH3类似物成为肿瘤研究领域的新热点，大量的小分子化合物不断涌现，如抑制Bcl-2/Bcl-xL的ABT-737及其口服衍生物ABT-263、抑制Bcl-2的ABT-199等。对于那些依赖Bcl-2和/或Bcl-xL存活的肿瘤细胞而言，这些BH3类似物的效果很好，但一些肿瘤细胞由于高表达Mcl-1而对它们抵抗[1]，因此，研发出能选择性抑制Mcl-1的BH3类似物很有必要。UMI-77是2014年通过高通量筛选方法鉴定出来的Mcl-1小分子抑制剂，在胰腺癌的体内和体外实验中都有很好的效果[2]。本研究将UMI-77应用到胃癌细胞，在对UMI-77抵抗的胃癌细胞中，将UMI-77和Bcl-2/Bcl-xL的抑制剂ABT-737联用，观察联用后的细胞凋亡情况，并探讨其分子机制。
1 材料与方法 1.1 材料 1.1.1 试剂RPMI 1640培养基，购自Gibco公司；胎牛血清，购自Hyclone公司；UMI-77、ABT-737，购自Selleck公司；MTS购自Promega公司；FITC Annexin V凋亡检测试剂盒，购自BD Pharmingen公司；MitoProbe JC-1试剂盒，购自Invitrogen公司；BCA蛋白定量试剂盒、RIPA裂解液，购自碧云天生物技术有限公司；抗pro-caspase-3、多聚腺苷二磷酸核糖聚合酶-1(poly [ADP-ribose] polymerase-1，PARP-1)、Survivin、Bcl-2和Mcl-1单克隆抗体，购自Santa Cruz公司；抗cleaved-caspase-3、caspase-9、X连锁凋亡抑制蛋白(X-linked inhibitor of apoptosis protein，XIAP)、细胞凋亡抑制蛋白1(cellular inhibitor of apoptosis protein 1，cIAP1)、cIAP2、Bcl-xL、Bim、p53上调凋亡调节因子(p53 upregulated modulator of apoptosis，PUMA)单克隆抗体，购自Cell Signaling公司；抗NOXA单克隆抗体，购自Abcam公司；抗GAPDH单克隆抗体、辣根过氧化物酶标记的山羊抗小鼠IgG及山羊抗兔IgG，购自北京中杉金桥生物技术有限公司。
1.1.2 仪器全自动酶标仪(Bio Tek公司)；流式细胞仪(BD公司)；Mini-PROTEAN Tetra电泳仪(Bio-Rad公司)；全自动化学发光图像分析系统(Tanon公司)；倒置相差显微镜(Olympus公司)。
1.2 方法 1.2.1 细胞培养人胃癌细胞MGC-803、HGC-27，购自中国科学院上海细胞库。细胞用含体积分数为0.10胎牛血清的RPMI 1640培养基，37 ℃、5% CO2饱和湿度的培养箱中培养。
1.2.2 MTS法检测细胞存活率取对数生长期的细胞，以适当密度接种于96孔板(每孔100 μL)，次日细胞汇合度达70%，加入不同浓度的UMI-77、ABT-737或同时加入UMI-77和ABT-737，对照组加入含有与药物组同等含量的DMSO，调零孔仅加等体积的培养液、无细胞，每组设6个复孔。处理48 h或24 h后，每孔加10 μL MTS，37 ℃避光孵育1~4 h，在酶标仪上检测主波长为490 nm、参考波长为630 nm处的吸光度(OD)值，计算细胞存活率：细胞存活率/%=(实验组OD值-调零孔OD值)/(对照组OD值-调零孔OD值)×100%。
1.2.3 Annexin V-FITC/PI染色流式细胞术检测细胞凋亡取对数生长期的HGC-27细胞，以适当密度接种于24孔板，次日细胞汇合度达70%，分别加UMI-77(10 μmol·L-1)、ABT-737(10 μmol·L-1)、UMI-77(10 μmol·L-1)+ABT-737(10 μmol·L-1)处理，对照组(Control)加入含有与处理组同等含量的DMSO，每组设3个复孔。24 h后，分别收集孔中的上清至流式管中，贴壁的细胞用不含EDTA的胰酶消化下来，也收集到对应的流式管中。用冷PBS洗2次，每管细胞沉淀中加100 μL 1×binding buffer，充分吹打混匀。每管加5 μL Annexin V-FITC和5 μL PI，室温避光染色15 min，最后每管加400 μL 1×binding buffer，立即上流式细胞仪检测细胞凋亡，FlowJo 7.6软件分析结果，以Annexin V(+)细胞所占比例定为细胞凋亡率。
1.2.4 JC-1染色流式细胞术检测线粒体膜电位(Δψm)的变化种板、处理及收集步骤同“1.2.3”，每管细胞沉淀中加1 mL温PBS重悬，阳性对照管加1 μL 50 mmol·L-1的碳酰氰基-对-氯苯腙(carbonyl cyanide 3-chlorophenylhydrazone，CCCP)(终浓度为50 μmol·L-1)，37 ℃避光处理5 min。然后每管加2.5 μL 200 μmol·L-1的JC-1(终浓度为0.5 μmol·L-1)，37 ℃避光染色30 min。每管加2 mL温PBS洗1次，最后每管加500 μL温PBS重悬，立即上流式细胞仪检测ΔΨm的变化情况。FlowJo 7.6软件分析结果，当ΔΨm较高时，JC-1聚集在线粒体基质中，形成聚合物，产生红色荧光。当ΔΨm较低时，JC-1为单体，产生绿色荧光。
1.2.5 Western blot检测凋亡相关蛋白的表达收集对照组(Control)、UMI-77(10 μmol·L-1)、ABT-737(10 μmol·L-1)、UMI-77(10 μmol·L-1)+ABT-737(10 μmol·L-1)处理24 h的细胞，加入RIPA裂解液，冰上裂解30 min，4 ℃、14 000×g离心30 min后，取上清，即细胞总蛋白。采用BCA法蛋白定量，取20 μg总蛋白进行SDS-PAGE，随后转移至硝酸纤维素膜上，用含50 g·L-1脱脂奶粉的封闭液室温封闭1 h，一抗4 ℃孵育过夜；次日用TBST洗3次，每次10 min，二抗室温孵育1 h，TBST洗3次，每次10 min。ECL显色，在化学发光图像分析系统中曝光成像。应用Image J软件分析条带的灰度值，以目的蛋白和内参蛋白(GAPDH)条带灰度值之比表示目的蛋白的相对表达水平。
1.2.6 统计学方法采用SPSS 17.0和GraphPad Prism软件对实验结果进行统计学分析。计量资料以x±s表示，多组间比较采用单因素方差分析，组内两两比较采用Bonferroni检验或Dunnett's检验。
2 结果 2.1 HGC-27细胞对UMI-77不敏感用UMI-77(1、2、5、10、20、50 μmol·L-1)处理MGC-803和HGC-27细胞48 h，MTS法检测细胞存活率。Fig 1结果显示，MGC-803细胞对UMI-77很敏感，随着UMI-77浓度升高，细胞存活率逐渐降低，呈现一定的浓度依赖性；而HGC-27细胞对UMI-77抵抗，20 μmol·L-1以下的浓度几乎对细胞存活无影响，只有在浓度高达50 μmol·L-1时，细胞才大量死亡。
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| Fig 1 Effect of UMI-77 on viability of gastric cancer MGC-803 and HGC-27 cells (x±s, n=6) **P<0.01 vs control |
在对UMI-77不敏感的HGC-27细胞中，分别将UMI-77(1、2、5、10 μmol·L-1)与10 μmol·L-1的ABT-737联用24 h，MTS法检测细胞存活率。如Fig 2A所示，10 μmol·L-1的ABT-737与UMI-77(1、2、5、10 μmol·L-1)联用时，能明显降低细胞存活率，与单用UMI-77或单用ABT-737相比，差异均有统计学意义(P<0.01)。进一步采用Annexin V-FITC/PI染色流式细胞术检测细胞凋亡情况，如Fig 2B所示，10 μmol·L-1 UMI-77与10 μmol·L-1 ABT-737联用24 h后，Annexin V (+)细胞所占的比例明显增多，且其中大部分死细胞都位于右下象限，说明确实发生了凋亡。
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| Fig 2 Effect of treatment with UMI-77 plus ABT-737 on cell death in HGC-27 cells (x±s, n=6) A: Cell viability after treatment with UMI-77, ABT-737 alone or combination for 24 h; B: Apoptotic rate after treatment with UMI-77 plus ABT-737 for 24 h. **P<0.01 vs control; ##P<0.01 vs 10 μmol·L-1 UMI-77; △△P<0.01 vs 10 μmol·L-1 ABT-737. |
JC-1染色流式细胞术检测线粒体膜电位(ΔΨm)的变化，Fig 3A结果显示，10 μmol·L-1 UMI-77或10 μmol·L-1 ABT-737单独处理24 h时Δψm较高，JC-1大多处于聚合状态，而UMI-77和ABT-737联用后Δψm急剧下降。Western blot结果显示(Fig 3B)，UMI-77单用时caspases不激活，ABT-737单用时，caspases有一定程度的活化，但UMI-77和ABT-737联用后，caspase-9、caspase-3和PARP-1的裂解更加明显，表现为pro-caspase-9、pro-caspase-3和PARP-1的表达水平降低，同时cleaved-caspase-9、cleaved-caspase-3和cleaved-PARP-1出现，说明UMI-77和ABT-737联用是通过线粒体途径导致HGC-27细胞发生凋亡。
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| Fig 3 Effect of combination of UMI-77 with ABT-737 on mitochondrial membrane potential and caspases activation (x±s, n=3) A: Effect on the mitochondrial membrane potential using JC-1 staining by flow cytometry; B: Activation of caspase-9, caspase-3 and PARP-1. *P<0.05, **P<0.01 vs control. |
Western blot检测IAP家族和Bcl-2家族在单用或联用UMI-77与ABT-737前后的表达情况，如Fig 4所示，IAP家族中的XIAP、cIAP1和cIAP2在UMI-77与ABT-737联用时下降，其中以XIAP和cIAP2的下降尤为明显，Survivin的表达没有变化；“BH3-only”蛋白中的NOXA明显增高，PUMA明显降低，抗凋亡蛋白中的Bcl-2略有升高、Mcl-1略有下降，但变化的程度很有限，而Bcl-xL和Bim没有任何改变。
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| Fig 4 Effect of treatment with UMI-77, ABT-737, either alone or in combination, on expression levels of IAP family and Bcl-2 family members (x±s, n=3) **P<0.01 vs control |
以Bcl-2家族中的抗凋亡蛋白为靶点设计的小分子抑制剂，被称为BH3类似物，是一类新的抗肿瘤制剂，目前，研究得较为清楚的是ABT-737、ABT-263、ABT-199等。ABT-737和ABT-263在体内和体外实验中都具有很好的抗肿瘤活性，已进入Ⅰ/Ⅱ期临床试验阶段。ABT-199在2016年4月经美国FDA批准已经上市，用于染色体17p缺失的慢性淋巴细胞白血病的治疗，是第1个进入临床的BH3类似物，这一具有里程碑意义的事件，极大地激发了人们研究BH3类似物的热情。
Mcl-1是抗凋亡蛋白里比较独特的成员，它只含有Bcl-2同源结构域1~3(Bcl-2 homology domain，BH1~3)，尽管如此，它的分子量却最大，由350个氨基酸残基组成。其氨基端含有2个脯氨酸/谷氨酸/丝氨酸/苏氨酸(proline/glutamic acid/serine/threonine，PEST)序列，使得Mcl-1半衰期很短(<1~4 h)。Mcl-1在多种肿瘤中高表达，与肿瘤的发生、发展和不良预后相关[3]。利用基因转录或蛋白质翻译的抑制剂[4]或RNA干扰[5]办法下调Mcl-1，能增加肿瘤细胞对化疗药物或BH3类似物(ABT-737、ABT-199等)的敏感性，因此，研发出能特异性抑制Mcl-1的BH3类似物很有必要。
与针对Bcl-2和Bcl-xL的抑制剂相比，Mcl-1抑制剂的研究稍显滞后，最近几年才陆续出现几个选择性针对Mcl-1的小分子抑制剂，如Maritoclax[6]、UMI-77、A-1210477[7]和S63845[8]。UMI-77是2014年Abulwerdi等[2]鉴定出的一种选择性的Mcl-1抑制剂，能与Mcl-1的BH3结合槽结合，阻止Mcl-1/Bcl-2相关X蛋白(Bcl-2 associated X protein，Bax)和Mcl-1/Bcl-2同源拮抗者(Bcl-2 homologous antagonist killer，Bak)复合物形成，经线粒体途径诱导胰腺癌细胞发生凋亡。在胰腺癌异种移植物重症联合免疫缺陷(severe combined immunodeficiency，SCID)小鼠模型中，UMI-77也显示出很强的抗肿瘤活性，且对周围组织无毒性。此外，UMI-77能增强胰腺癌细胞对放疗的敏感性[9]，在神经胶质瘤[10]和食管鳞癌[11]中，将UMI-77与TRAIL或顺铂联用也能诱导更明显的细胞凋亡。
本研究将UMI-77作用于两株胃癌细胞，发现MGC-803细胞对之很敏感，单独使用就可以达到很好的效果，而HGC-27细胞对之抵抗，因此，如何克服HGC-27细胞对UMI-77的抵抗就是本研究的重点。HGC-27细胞对低浓度的ABT-737也不太敏感，但是当UMI-77和ABT-737联用后，细胞存活率明显下降，超过一半的细胞表现为Annexin V(+)，且其中的绝大多数位于右下象限，说明细胞确实发生了凋亡。此外，前体形式的pro-caspase-9、pro-caspase-3和PARP-1明显减少，与之相伴着裂解形式的cleaved-caspase-9、cleaved-caspase-3及cleaved-PARP-1出现，说明caspases级联反应被激活；线粒体膜电位的下降，说明线粒体参与了细胞凋亡过程，这些都充分证实UMI-77和ABT-737联用是通过线粒体途径诱导HGC-27细胞发生凋亡。
为了了解凋亡相关调节蛋白在UMI-77和ABT-737联用中的作用，观察Bcl-2家族中的抗凋亡蛋白(Bcl-2、Bcl-xL、Mcl-1)、“BH3-only”蛋白(Bim、PUMA、NOXA)，以及IAP家族中的XIAP、cIAP1、cIAP2、Survivin的表达水平，发现XIAP、cIAP1和cIAP2在联用时明显下调。IAP家族是一组内源性的抑制细胞凋亡的蛋白，包括XIAP、cIAP1、cIAP2、Survivin等8个成员。XIAP能直接结合到caspase-9、caspase-7和caspase-3上，从而抑制它们的活性，而凋亡发生时，从线粒体释放出来的第2个线粒体来源的caspases激活剂(second mitochondria-derived activator of caspases，SMAC)能解除XIAP对caspases的抑制。cIAP1和cIAP2能以高亲和力结合SMAC，阻止SMAC对XIAP的抑制作用，从而间接地抑制caspases。越来越多的证据表明，IAP家族在多种肿瘤细胞中高表达，其下调或失活会引起凋亡的增加[12]，本研究中，XIAP、cIAP1和cIAP2的下降可能正是导致凋亡增加的关键因素。抗凋亡蛋白Bcl-2升高和Mcl-1降低的程度很有限，而“BH3-only”蛋白NOXA的上调和PUMA的下调却十分明显。“BH3-only”蛋白启动凋亡是通过直接激活Bax/Bak，或者抑制抗凋亡蛋白的作用来达成。如Bim、PUMA能抑制Bcl-2、Bcl-xL和Mcl-1，而NOXA只能抑制Mcl-1[13]。抗凋亡蛋白抑制凋亡主要是通过隔离“BH3-only”蛋白，或者阻止Bax/Bak发生同源寡聚化。在本研究中，“BH3-only”蛋白与抗凋亡蛋白之间究竟有着怎样复杂的相互作用尚不清楚，可能是NOXA的增加抑制了Mcl-1，另外，Bcl-2的增加又导致了PUMA的下降，这些问题还需要今后进一步深入的研究。
综上所述，不同的胃癌细胞对Mcl-1小分子抑制剂UMI-77的敏感性不同，对于那些对UMI-77抵抗的细胞，可以通过与Bcl-2/Bcl-xL抑制剂ABT-737联用的方式来增强杀伤效应，两者联用能更有效地激活线粒体凋亡途径。本研究的结果将有望拓展Mcl-1小分子抑制剂在更多实体肿瘤中的应用，为此类抑制剂最终进入临床提供理论依据。
( 致谢: 本实验在安徽医科大学基础医学院免疫学实验室完成，感谢实验室老师和同学们给予的帮助，特别感谢综合实验室的桂丽老师在流式细胞术方面提供的支持！)
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