2. 潍坊医学院 形态学实验室，山东 潍坊 261053
2. Lab of Morphology, Weifang Medical University, Weifang Shandong 261053, China
在临床工作中，移植、断肢再植、骨筋膜室综合征等均能引起骨骼肌缺血/再灌注损伤(ischemia/reperfusion injury，IRI)[1]。IRI包含多个病理生理过程，例如在炎症介质作用下，可引起全身炎症反应，导致多器官功能障碍等[2]，威胁患者的生命。因此，防治肢体IRI备受临床医生的关注。我们前期研究发现[3-4]，脉络宁注射液通过影响超氧化物歧化酶、8-异前列腺素F2α、一氧化氮合酶等，减轻骨骼肌IRI，但其保护作用及机制仍需进一步探讨。本实验拟研究脉络宁注射液能否通过影响肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor alpha, TNF-α)和核转录因子κB(nuclear factor-kappa B, NF-κB)而发挥保护作用。
1 材料与方法 1.1 实验动物清洁级健康♂成年新西兰白兔30只，由青岛康大生物科技有限公司提供。实验动物生产许可证号：SCXK(鲁)20160002，实验动物使用许可证号：SYXK(鲁)20160012。兔龄90 d，体质量(2.3±0.2)kg。饲养环境湿度(50±10)%，温度(25±1)℃，普通饲料饲养，自由饮水。
1.2 试剂与仪器脉络宁注射液(金陵药业股份有限公司南京金陵制药厂生产，10 mL/支，生产批号：20170337)；兔TNF-α ELISA检测试剂盒、兔NF-κB ELISA检测试剂盒，均购自上海通蔚实业有限公司。TDZ5-WS离心机(长沙湘仪离心机仪器有限公司)；Bio-Rad 680型酶标仪(美国Bio-Rad公司)；Hitachi H-7700型透射电镜(日本Hitachi公司)。
1.3 动物模型的建立及分组根据随机数字表法，将30只动物分为3组：对照组(Control，C)、IRI组(I)、IRI+脉络宁(Mailuoning，M)组，每组10只。术前禁食12 h，左侧耳缘静脉注射30 g·L-1的戊巴比妥钠麻醉，给药剂量30 mg·kg-1。M组及I组动物，用气囊止血带(长25 cm，宽2 cm)环绕右侧后肢根部(膝上约2.5 cm处)，保持气压在36~40 kPa，阻断动脉供血及静脉回流，造成肢体完全缺血。缺血4 h后，将气囊止血带松解，恢复血供以形成再灌注。然后，经左侧耳缘静脉，M组动物注射脉络宁注射液1.5 mL·kg-1、I组和C组动物注射生理盐水1.5 mL·kg-1。
1.4 检测指标及方法 1.4.1 TNF-α和NF-κB检测每组动物在再灌注2、6、10 h时，从右侧耳缘静脉取血液，抗凝、离心、取血浆，用于检测TNF-α；从右侧后肢取胫前肌组织，称重、研磨，制成匀浆后离心、取上清，用于检测NF-κB。两者皆采用ELISA法测定，按照检测试剂盒步骤操作。
1.4.2 透射电镜观察从每组中随机选择2只动物，在再灌注2、6、10 h时，取右侧后肢胫前肌组织。将骨骼肌标本切成1 mm×1 mm×1 mm大小，戊二醛、锇酸作前、后固定，梯度乙醇脱水，经包埋、超薄切片、捞片、铅铀染色等步骤处理，用透射电镜对肌组织超微结构进行观察并摄片。
1.4.3 统计学分析实验所得数据以x±s表示，用SPSS 19.0统计软件对数据进行分析。单因素方差分析用于多组独立样本均数的比较，若差异有统计学意义，则用SNK检验进行均数的两两比较。
2 结果 2.1 脉络宁注射液对兔肢体IRI血浆中TNF-α浓度的影响Tab 1结果显示，同一组内比较，对照组TNF-α浓度差异无统计学意义(P>0.05)，IRI组和脉络宁组TNF-α浓度逐渐升高(P < 0.05)。同一时间点组间比较，IRI组TNF-α浓度高于对照组(P < 0.01)，脉络宁组TNF-α浓度高于对照组(P < 0.01)，但低于IRI组(P < 0.05)。
| Group | Time | ||
| 2 h | 6 h | 10 h | |
| Control | 9.42±0.43 | 9.57±0.44 | 9.76±0.51 |
| IRI | 12.13±0.62▲** | 12.98±0.69** | 13.83±0.96▲** |
| Mailuoning | 11.52±0.61△**# | 12.31±0.53**# | 12.99±0.89△**# |
| ▲P < 0.05 vs 6 h of IRI; △P < 0.05 vs 6 h of Mailuoning; **P < 0.01 vs control; #P < 0.05 vs IRI | |||
Tab 2结果显示，同一组内比较，对照组或脉络宁组各组NF-κB浓度差异无统计学意义(P>0.05)，IRI组NF-κB浓度逐渐升高(P < 0.05)。同一时间点组间比较，IRI组NF-κB浓度高于对照组(P < 0.01)，脉络宁组NF-κB浓度低于IRI组(P < 0.01)，脉络宁组与对照组比较，NF-κB浓度差异无统计学意义(P>0.05)。
| Group | Time | ||
| 2 h | 6 h | 10 h | |
| Control | 0.587±0.035 | 0.561±0.049 | 0.549±0.032 |
| IRI | 0.775±0.066▲** | 0.860±0.067** | 0.941±0.087▲** |
| Mailuoning | 0.627±0.052## | 0.613±0.062## | 0.607±0.057## |
| ▲P < 0.05 vs 6 h of IRI; **P < 0.01 vs control; ##P < 0.01 vs IRI | |||
对照组骨骼肌超微结构正常。IRI组在再灌注2 h时细胞核结构正常，部分线粒体水肿、嵴模糊或消失，部分粗面内质网可见颗粒融合或脱颗粒现象；在再灌注6、10 h时，核周间隙增宽，线粒体空泡样变、嵴断裂，粗面内质网颗粒融合，横小管粗细不均，双侧终池增大。脉络宁组2、6、10 h时可见完整的核仁，核周间隙变化不明显，线粒体较大、嵴清晰，三联体完整，肌纤维接近正常状态。
3 讨论骨骼肌IRI过程中存在大量炎性细胞因子[5]，而NF-κB作为转录因子广泛存在于真核细胞内，与炎症反应密切相关[6]。炎性细胞因子一方面可介导炎症反应，另一方面又是NF-κB的刺激剂[7]，可以和IRI产生的氧自由基一起作用于NF-κB的激活。NF-κB可诱导不同炎性靶基因的过度或持续表达，经趋化、浸润、聚集炎性细胞，产生炎性效应分子，而造成炎症反应[8]。炎性细胞因子和NF-κB的相互刺激，使炎症反应持续存在或放大[9]，导致骨骼肌细胞水肿和损伤。若阻断两者的互相激活，可能会起到减轻炎症反应的作用，进而保护肌细胞，减轻IRI。
本实验选取了具有代表性的炎性细胞因子TNF-α及转录调节因子NF-κB作为观测指标。结果显示，兔后肢经缺血/再灌注处理，血浆TNF-α浓度及肌组织匀浆NF-κB浓度在再灌注2、6、10 h逐渐升高；骨骼肌超微结构与对照组比较，也出现逐渐加重的损伤改变。经脉络宁注射液处理，血浆TNF-α浓度及肌组织匀浆NF-κB浓度在再灌注2、6、10 h时与IRI组同期比较明显降低，NF-κB浓度与对照组无明显差异；骨骼肌超微结构优于IRI组，与对照组差别不大，肌组织形态基本正常。
综上所述，脉络宁注射液可降低缺血/再灌注后血浆TNF-α和肌组织NF-κB浓度的升高程度，减轻肌细胞水肿，有利于维持细胞内超微结构的完整性，对骨骼肌IRI起到保护作用。其作用机制可能是通过阻碍TNF-α与NF-κB的相互激活过程而减轻炎症反应。本实验从蛋白表达的水平研究了脉络宁对IRI中TNF-α和NF-κB的影响，但未在基因水平上进行研究，有待今后进一步探讨。
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