糖尿病是以升高血糖为特征的代谢性疾病,由胰岛素分泌缺陷或其生物作用受损引起,可引发多种并发症[1-2],主要分为1型糖尿病(type 1 diabetes mellitus,T1DM)和2型糖尿病(type 2 diabetes mellitus,T2DM)。我国糖尿病以T2DM为主,病因和发病机制目前均不明确[3],明显特征是既有胰岛素抵抗,又有胰岛素分泌不足[4]。近年来,T2DM已成为威胁人类健康的常见疾病[5]。
金露梅(Fruticosa potentilla L.)为蔷薇科(Rosaceae)委陵菜属(Potentilla)落叶灌木,广泛分布于北温带地区,主要生于海拔1 000~4 500 m的林缘、水甸子、草原、草地及高山灌丛中[6]。前期研究发现,金露梅提取物对α-葡萄糖苷酶、α-淀粉酶和醛糖还原酶均具有抑制作用。本文研究金露梅95%甲醇提取乙酸乙酯萃取部位(MEE)对T2DM大鼠血糖变化的影响,以及对胰岛素、抵抗素、瘦素、葡萄糖激酶(GK)和葡萄糖-6-磷酸酶(G-6-Pase)基因表达的影响,探究金露梅抗T2DM的作用机制。青藏高原地区金露梅资源十分丰富,目前还未有系统研究,民间相关资料记载金露梅有降糖、降脂的作用,本研究为后期金露梅的开发提供理论基础。
1 材料 1.1 实验动物普通级SD大鼠,♂,体质量(180±20)g,西安交通大学实验动物中心提供,批号:SCSK(陕)2012-003。
1.2 药物与试剂金露梅原植物采自青海省大通达坂山(海拔3 006 m,37° 8' 42" N,101° 50' 32" E),MEE提取分离参照文献[6]。TRIzol购于Invitrogen Life Technologies;链脲佐菌素(STZ),购于美国Sigma公司;逆转录试剂盒和荧光PCR试剂盒,购于大连宝生物工程公司;葡萄糖试剂盒,购于上海荣盛生物药业公司。
1.3 仪器XMARK全自动酶标仪、Thermal Cycler PCR扩增仪、IQ5荧光定量PCR仪,均购于Bio-Rad公司。
2 方法 2.1 造模与给药参照文献[7],进行造模与给药。给药剂量分别为MEE高剂量组(500 mg·kg-1)、MEE低剂量组(250 mg·kg-1)、盐酸二甲双胍阳性药物组(75 mg·kg-1)、糖尿病模型组(等量水)和空白对照组(等量水)。
2.2 血糖测定在给药前、给药7、14、21、28 d时,所有大鼠禁食不禁水12 h,经尾静脉采血,用葡萄糖试剂盒检测大鼠的空腹血糖,结果以mmol·L-1表示。
2.3 糖脂代谢关键酶和激素的表达量测定给药28 d后,大鼠股动脉取血处死,剖开腹腔,取肝脏组织、胰腺组织、肾周脂肪组织各100 mg,放入冷生理盐水中洗净血污,用无菌吸水纸吸干水分,液氮冷冻。按试剂盒说明书操作,提取各组织总RNA,紫外分析检测RNA纯度、浓度和完整性。以Oligo dT为引物,按逆转录试剂盒说明书程序操作合成第一链cDNA。
2.4 qRT-PCR反应从NCBI获得大鼠胰岛素、抵抗素、瘦素、GK、G-6-Pase、GAPDH基因序列,截取基因序列中的CDS,采用Primer 3 Input设计引物,并采用NCBI-BLAST检验引物特异性。引物序列和产物大小参照文献[7]。qRT-PCR反应采用试剂盒,在荧光定量PCR仪进行,反应条件参照文献[7]。选取GAPDH作为参照基因,采用2-ΔΔCt计算相对表达量[8]。
2.5 统计学方法实验数据采用SPSS 17.0进行统计学分析,结果用x±s表示,并进行单因素方差分析,组间两两比较采用LSD法。
3 结果 3.1 血糖变化如Tab 1所示,经药物治疗14 d后,二甲双胍组、MEE高剂量组与模型组相比,空腹血糖值均有下降(P < 0.05),降糖率分别为15.63%、12.44%。治疗21 d后,二甲双胍组、MEE高、低剂量组与模型组相比,空腹血糖值均有明显下降(P < 0.01,P < 0.05),降糖率分别为24.38%、20.49%、19.67%。治疗28 d后,二甲双胍组、MEE高、低剂量组与模型组相比,空腹血糖值均有明显下降(P < 0.01),降糖率分别为38.44%、34.71%、28.54%。表明MEE能明显降低T2DM大鼠的血糖。
Group | Preadministration of blood glucose | 7 d blood sugar | 14 d blood sugar | 21 d blood sugar | 28 d blood sugar |
Control | 4.81±1.08 | 5.67±1.54 | 5.21±1.19 | 5.02±1.36 | 4.87±1.57 |
Model | 20.21±3.17## | 19.85±3.89## | 20.05±4.25## | 19.23±3.54## | 20.06±3.87## |
Metformin | 19.07±2.98## | 18.12±3.24## | 16.09±2.95##* | 14.42±2.87##** | 11.74±1.95##** |
MEE-H | 19.13±2.97## | 18.77±3.89## | 16.75±3.09##* | 15.21±3.92##** | 12.49±3.47##** |
MEE-L | 19.97±3.05## | 19.03±2.49## | 17.95±4.58## | 16.04±3.49##* | 14.27±2.98##** |
##P < 0.01 vs control; *P < 0.05, **P < 0.01 vs model |
如Tab 2所示,与模型组相比,二甲双胍组和MEE高、低剂量组均能明显上调胰岛素基因表达(P < 0.05),明显下调抵抗素和瘦素基因表达(P < 0.01),明显提高GK基因表达(P < 0.05);与模型组相比,二甲双胍组、MEE高剂量组能明显下调G-6-Pase基因表达(P < 0.01),MEE低剂量组能明显下调G-6-Pase基因表达(P < 0.05)。
Group | Insulin | Resistin | Leptin | GK | G-6-Pase |
Control | 1.00 | 1.00 | 1.00 | 1.00 | 1.00 |
Model | 0.42±0.29## | 3.97±1.65## | 2.79±0.53## | 0.85±0.23## | 1.27±0.37## |
Metformin | 0.69±0.18##* | 1.82±0.37##** | 0.82±0.33##** | 1.09±0.39##* | 0.68±0.22##** |
MEE-H | 0.72±0.33##* | 1.97±0.75##** | 1.11±0.41##** | 1.17±0.42##* | 0.71±0.25##** |
MEE-L | 0.68±0.26##* | 2.02±0.66##** | 1.32±0.47##** | 1.02±0.33##* | 0.84±0.29##* |
##P < 0.01 vs control; *P < 0.05, **P < 0.01 vs model |
在本研究中,用金露梅95%甲醇提取乙酸乙酯萃取部位治疗后,T2DM大鼠餐后血糖明显降低,抵抗素、瘦素水平均下调,葡萄糖激酶基因表达明显上升,葡萄糖-6-磷酸酶基因表达明显下降。表明金露梅95%甲醇提取乙酸乙酯萃取部位中可能存在某种成分,可以对胰岛素、抵抗素、瘦素三者的相互作用产生影响,形成某种调节通路,且能调节GK、G-6-Pase的基因表达,从而调节T2DM中的某些脂代谢紊乱。综上所述,本研究发现金露梅能够有效降低T2DM大鼠餐后血糖,且能够调节多种糖脂代谢相关激素的表达,部分恢复T2DM大鼠胰岛素水平,以达到抵抗T2DM的目的。
[1] |
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