脑血管疾病是目前致使人类死亡的三大疾病之一，是我国甚至世界医疗机构和卫生系统单位所面临的需要攻克的难题。其中缺血性脑卒中在脑血管疾病中发病率最高，约占80%，是目前严重危害人类健康的疾病之一[1-2]。片仔癀(Pien-Tze-Huang，PZH)是由牛黄、蛇胆、麝香、三七等中药经发酵制成的中成药，是国家一级中药保护品种，常用于热毒血瘀所致急慢性病毒性肝炎、痈疽疔疮、无名肿毒及各种炎症，具有清热解毒、凉血化瘀、消肿止痛的功效[3]。已有文献报道[4-5]以及我们研究[6]证实，片仔癀能明显改善大脑中动脉闭塞(middle cerebral artery occlusion，MCAO)所致局灶性脑缺血/再灌注大鼠的神经功能缺损，降低脑梗死体积，具有脑保护作用。但片仔癀对N-甲基-D-天冬氨酸受体1(N-methyl-D-aspartic acid receptor 1，NMDAR1)和谷氨酸受体2(glutamate receptor 2，GluR2)的mRNA及蛋白表达的影响尚未见报道，因此，本研究为了进一步探索片仔癀对MCAO大鼠神经保护的可能机制，拟对此进行研究，从而为片仔癀开发治疗缺血性脑卒中提供实验依据，扩大其临床应用范围。
1 材料 1.1 实验动物健康SD大鼠，♂，SPF级，体质量(300±10)g，由福建中医药大学实验动物中心提供并饲养，许可证号：SYXK(闽)2014-0005。
1.2 药物与试剂片仔癀(漳州片仔癀药业股份有限公司，批号1601003)；线栓(广州佳灵生物技术有限公司，货号L3800)；异氟烷(深圳市瑞沃德生命科技有限公司，货号R510-22)；2, 3, 5-氯化三苯基四氮唑(TTC)(美国Sigma公司，货号T8877)；RNA isolater(南京诺唯赞生物科技有限公司，货号R401-01)；Revert Aid First Strand cDNA Synthesis Kit(美国Thermo公司，货号K1622)；SYBR Master Mix(美国ABI公司，货号R11022)；RIPA裂解液、BCA蛋白定量检测试剂盒(碧云天生物技术有限公司)；羊抗NMDAR1(美国Santa Cruz公司，货号sc-1468)；兔抗GluR2(英国Abcam公司，货号ab206293)；兔抗GAPDH(美国CST公司，货号2118)；PCR引物由上海捷瑞生物工程有限公司合成。
1.3 仪器R540小动物麻醉机(深圳市瑞沃德生命科技有限公司)；ND2000C紫外可见分光光度计(美国Thermo公司)；Infinite M200 Pro多功能酶标仪(瑞士TECAN公司)；C1000普通PCR仪(美国Bio-Rad公司)；7900HT实时荧光定量PCR仪(美国ABI公司)；ChemiDoc XRS+凝胶成像分析系统、Mini PROTEAN Tetra小型垂直电泳槽、转印槽(美国Bio-Rad公司)。
2 方法 2.1 实验动物分组与给药用锉刀将片仔癀锭剂制备成细粉，用双蒸水制成36 g·L-1的混悬液。药物配制后，于4 ℃冰箱保存备用，用前摇匀。将适应性喂养后符合体质量要求的大鼠随机分为假手术组(Sham)、模型对照组(MCAO)和片仔癀预给药组(MCAO+PZH)，每组12只。于造模前4 d开始灌胃给药：MCAO+PZH组灌胃片仔癀药液(180 mg·kg-1)，每天早晚各1次，末次给药为造模前30 min。Sham组及MCAO组同法给予等量双蒸水。
2.2 模型的制备5%异氟烷深度麻醉大鼠后，用2%异氟烷维持大鼠麻醉状态，参照课题组的造模方法[6-8]，固定大鼠仰卧位，剪开颈部正中皮肤，钝性分离皮下组织，将右侧颈总、颈外、颈内3条动脉分离出来，用缝合线结扎颈总、颈外动脉。动脉夹暂时夹闭颈内动脉远心端，应用眼科剪45°在颈总动脉近心端剪一小口，插入合适规格的线栓，使其进入颈内动脉约18~20 mm，遇到阻力即停止，将线栓和颈内动脉一起结扎，消毒缝合皮肤。1.5 h后将大鼠再次麻醉，拆开缝合处，将线栓拔出，实现再灌注。Sham组仅分离颈总、颈外、颈内动脉，不进行结扎、栓塞。
2.3 神经功能评分参照Zea-Longa 5分制[9]对大鼠进行神经功能缺损评价。0分：无神经缺损体征；1分：提尾时病灶对侧前肢屈曲内收，不能完全伸展；2分：自由活动时向病灶对侧转圈；3分：行走时身体向病灶对侧倾倒；4分：意识丧失，不能自发行走。评分过程由2人共同完成。剔除造模过程中死亡大鼠，以及取材时发现蛛网膜下腔出血的大鼠。
2.4 TTC染色法测量大鼠脑梗死体积再灌注24 h时，10%水合氯醛过量深度麻醉处死大鼠，断头取脑，即刻放入鼠脑专用切片模具中，按2 mm的规格沿冠状位将大脑切成7片，将切片置于2% TTC中浸泡10 min，翻一面继续浸泡10 min，根据切片颜色结束染色过程，正常组织染成玫瑰红色，梗死组织则呈现苍白色。将切片按层面顺序排列整齐并进行拍照，使用ImageJ软件测定大脑健侧半脑面积及梗死侧正常组织面积，梗死面积由健侧半脑面积减去梗死侧正常组织面积，再乘以切片厚度(2 mm)即为梗死体积[10]。此计算方法可消除脑水肿的影响。
2.5 qPCR法检测大鼠缺血侧脑组织皮质NMDAR1、GluR2 mRNA表达于MCAO大鼠再灌注24 h时，取下各组大鼠缺血侧脑组织皮质部分，迅速投入液氮中，-80 ℃保存。采用TRIzol法提取总RNA，RNA定量后再逆转录成cDNA，以cDNA为模板，应用SYBR Green荧光染料进行实时荧光定量PCR反应，检测NMDAR1、GluR2基因的表达。NMDAR1引物上游序列为5′-TACAAGCGACACAAGGATGC-3′，下游序列为5′-GGGCTCTGCTCTACCACTCTT-3′，PCR扩增片段长度为108 bp；GluR2引物上游序列为5′-GCTGGTGGCTTTGATTGAGT-3′，下游序列为5′-TCTGCGAGGAAGATGGGTTA-3′，PCR扩增片段长度为101 bp；GAPDH引物上游序列为5′-CAACGGGAAACCCATCACCA-3′，下游序列为5′-ACGCCAGTAGACTCCACGACAT-3′，PCR扩增片段长度为96 bp。PCR扩增反应条件为50 ℃预热2 min，95 ℃预变性10 min，95 ℃变性15 s，60 ℃退火/延伸60 s，其中变性、退火和延伸程序往复运行40个循环。以GAPDH为内参，计算各组Ct值同相对应内参之间的差值，最终得到2-ΔΔCt值，即实验组与对照组之间mRNA的表达量相对差异值。
2.6 Western blot法检测大鼠缺血侧脑组织皮质NMDAR1、GluR2的蛋白表达取-80 ℃保存的大鼠缺血侧脑组织皮质部分，进行总蛋白的提取，BCA法测定蛋白浓度，加入适当量的蛋白上样缓冲液混匀、离心、变性、上样。每孔加入30 μg上样蛋白，SDS-PAGE凝胶电泳分离后，通过转膜仪将蛋白转移至PVDF膜，脱脂奶粉封闭2 h，NMDAR1(1:500)、GluR2(1:2 000)一抗4 ℃过夜，二抗室温孵育1.5 h，采用ECL发光试剂显色，并经ImageJ凝胶成像系统进行显影检测，分析目标条带NMDAR1、GluR2及内参GAPDH的灰度值，计算出目标蛋白与内参的比值，对组间差异进行统计学分析。
2.7 统计学分析用SPSS 20.0软件进行统计学分析，结果以x±s表示，神经功能评分的组间比较采用非参数检验(Kruskal-Wallis检验)，其余的组间比较采用单因素方差分析(one-way ANOVA)，方差齐时用LSD方法，不齐时用Games-Howell方法。
3 结果 3.1 片仔癀对MCAO大鼠神经功能评分的影响神经功能缺损评分显示(Fig 1)，与Sham组相比，MCAO组大鼠神经功能缺损评分明显升高(P < 0.01)，表明MCAO大鼠造模成功；与MCAO组相比，片仔癀预给药4 d，神经功能缺损评分明显降低(P < 0.05)。
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| Fig 1 Effects of PZH treatment on neurological score in MCAO rats (x±s, n=12) ##P < 0.01 vs sham; *P < 0.05 vs MCAO |
Fig 2的TTC染色结果显示，正常脑组织因含有脱氢酶而被染成红色，梗死脑组织因细胞膜损伤，导致脱氢酶被完全释放丢失而不被染色。Sham组大鼠的脑组织均呈红色，无梗死灶出现；MCAO组和片仔癀预给药组均出现了不同程度的脑组织梗死。与Sham组相比，MCAO组大鼠脑梗死体积明显增加(P < 0.01)；与MCAO组相比，片仔癀预给药4 d，脑梗死体积明显降低(P < 0.01)。
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| Fig 2 Effects of PZH treatment on infarct size in MCAO rats (x±s, n=6) ##P < 0.01 vs sham; **P < 0.01 vs MCAO |
Fig 3的qPCR结果显示，与Sham组相比，MCAO组NMDAR1、GluR2 mRNA表达水平明显降低(P < 0.05，P < 0.01)；与MCAO组相比，MCAO+PZH组NMDAR1、GluR2 mRNA表达水平明显升高(P < 0.05，P < 0.01)。
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| Fig 3 Effects of PZH treatment on NMDAR1 and GluR2 mRNA in MCAO rats(x±s, n=3) #P < 0.05, ##P < 0.01 vs sham; *P < 0.05, **P < 0.01 vs MCAO |
Fig 4的Western blot结果显示，与Sham组相比，MCAO组NMDAR1、GluR2蛋白表达水平明显降低(P < 0.05)；与MCAO组相比，片仔癀预给药组NMDAR1、GluR2蛋白表达水平明显升高(P < 0.05，P < 0.01)，与mRNA呈现一致的变化趋势。
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| Fig 4 Effects of PZH treatment on NMDAR1 and GluR2 protein in MCAO rats(x±s, n=3) #P < 0.05 vs sham; *P < 0.05, **P < 0.01 vs MCAO |
脑缺血引发神经元损伤的发病机制较为复杂，涉及到复杂的时间和空间级联反应。局部脑组织缺血缺氧，使得氧糖代谢和能量代谢受到阻碍，此过程持续一段时间后恢复血液供应，不仅未能及时恢复相应的功能，反而会出现更为严重的脑部损伤症状，称为局灶性脑缺血/再灌注损伤。目前，关于脑缺血/再灌注损伤的病理生理机制主要有细胞能量耗竭、氧化应激、兴奋性氨基酸毒性、钙离子超载、炎症反应、细胞凋亡等[11]。
研究发现，NMDAR是哺乳动物的中枢神经系统主要的兴奋性神经递质受体，可调节神经元的存活、树突和轴突结构的生长和突触新生与重塑、神经元环路的形成以及学习与记忆的活动[12]。NMDAR由NR1、NR2和NR3这3种不同亚基构成的阳离子通道。NR1作为NMDAR的主要功能亚基，在NMDA受体中可以单独调节离子通道的开闭，在中枢神经系统中广泛存在。在一定程度上，NMDAR可通过调控相应基因的表达，从而调节神经突触的可塑性和神经兴奋性毒性，是缺血性脑损伤中的重要离子通道调节受体[13]。研究表明，MCAO大鼠大脑缺血侧脑组织皮质部分NR1 mRNA和蛋白表达明显下降，片仔癀预先给药后，抑制皮质的NR1 mRNA和蛋白表达的下降。说明片仔癀改善MCAO大鼠的神经功能缺损以及降低梗死体积，与其促进大鼠皮质NR1的表达有关。从我们的研究结果和已有文献报道来看，NR1 mRNA及蛋白在MCAO大鼠中表达有升高与降低的两种相反结果，这可能与激活的NMDAR位于突触内或突触外的位置有关，位于突触外的NMDAR过度激活会导致兴奋性毒性，而位于突触内的NMDAR激活则可以促进细胞存活，提高干预治疗的可能性[14]。
AMPAR是由GluR1~4四种亚基组成的多聚体，决定其对钙离子通透性的关键分子是GluR2亚基。文献指出[15]，脑缺血引起GluR2亚基表达降低，导致AMPAR由钙不通透转变为钙通透，大量Ca2+通过已变构的AMPAR内流入神经元，最终促使兴奋性氨基酸毒性的发生，以至于神经元死亡。本研究中，MCAO大鼠大脑缺血侧脑组织皮质部分GluR2 mRNA和蛋白表达明显下降，片仔癀预先给药后，抑制了皮质的GluR2 mRNA和蛋白表达的下降。说明片仔癀对MCAO大鼠具有的保护作用，与其抑制大鼠皮质GluR2的表达下降有关。
综上所述，预先给予一定量的片仔癀能有效改善MCAO大鼠的神经功能损伤，减少MCAO大鼠梗死体积，这可能与其促进NMDAR1、GluR2 mRNA及蛋白表达有关。
( 致谢: 本课题在福建中医药大学生物医药研发中心及福建省科技厅福建省中药学重点实验室完成，非常感谢福建中医药大学实验动物中心对动物实验的大力支持! )
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