2. 南京市栖霞区妇幼保健院医教科,江苏 南京 210028;
3. 南京晓庄学院食品科学学院,江苏 南京 211117
2. Dept of Medical Education, Qixia District Maternity and Child Health Care Hospital of Nanjing, Nanjing 210028, China;
3. School of Food Technology, Nanjing Xiaozhuang University, Nanjing 211117, China
氨基葡萄糖(C6H13NO5,相对分子质量179.17)作为一种天然氨基单糖,被认为是机体合成蛋白聚糖和黏多糖的中间物,后者分布于胃肠黏膜、关节软骨基质和滑液中。美国FDA已将氨基葡萄糖归为骨关节炎患者的膳食补充剂[1]。氨基葡萄糖除了能缓解肠炎、骨关节炎外[2-3],还具有改善空间学习和记忆障碍[4]、刺激免疫、抗肿瘤、保护心脏和神经作用[5]。氨基葡萄糖可从甲壳类动物的壳聚糖和甲壳素外骨骼中提取,经过盐酸化或硫酸化后,变成稳定的可以口服的盐酸氨基葡萄糖(glucosamine hydrochloride,GH,相对分子质量215.63)和硫酸氨基葡萄糖(glucosamine sulfate,GS,相对分子质量277.25)[6-7]。虽然它们的总体药理作用相似,但也有研究发现存在一定的药效学差异[8]。而它们在药动学和生物利用度方面是否也存在差异,目前还未见报道。为了更好地指导临床用药,本课题以GS和GH中的氨基葡萄糖为研究对象,建立了灵敏度好、准确度高的LC-MS/MS定量分析方法,并对其在大鼠体内的药动学特征、绝对生物利用度和相对生物利用度进行了研究。
1 材料 1.1 药物与试剂GH标准品(批号1206A023)、GS标准品(批号816A022)、茶碱标准品(批号310B021),均购自北京索莱宝科技有限公司;GH片剂(江苏正大清江制药有限公司,批号171009);GS胶囊(浙江海正药业股份有限公司,批号71707172);乙腈、甲酸为色谱级;其他试剂为分析纯。
1.2 仪器Shimadzu LC-20AD XR型超快速液相色谱仪(UFLC),日本岛津公司,匹配SIL-20A自动进样器、DGU-20A3在线脱气机、CTO-20AC柱温箱;AB SCIEX QTRAP 5500型三重四级杆线性离子阱质谱仪,美国AB SCIEX公司;Analyst 1.5质谱工作站软件,美国AB SCIEX公司;Milli-Q纯水机,美国Millipore公司;Allegra 64R型台式高速冷冻离心机,美国贝克曼公司。
1.3 实验动物清洁级SD大鼠,♂,体质量(200±20)g,购自上海杰思捷实验动物有限公司,动物合格证号:SCXK(沪)2013-0006。
2 方法 2.1 溶液的配制 2.1.1 标准工作液的配制称取15.47 mg GS对照品(含氨基葡萄糖10 mg),置10 mL量瓶中,加纯水溶解,并稀释至刻度,配制成1 g·L-1的氨基葡萄糖储备液。
2.1.2 内标溶液的配制精密称取茶碱0.12 mg,用含质量分数0.1%甲酸的乙腈溶液配制成质量浓度为12 mg·L-1的储备液。再精密吸取上述储备液1 mL至50 mL量瓶,配制成质量浓度为0.24 mg·L-1的内标溶液。
2.2 动物分组、给药方法和样本采集SD大鼠24只,随机分为4组,每组6只:GH灌胃组、GH注射组、GS灌胃组、GS注射组。灌胃组剂量均为125 mg·kg-1,故氨基葡萄糖实际给药量GH组为103.86 mg·kg-1,GS组为80.78 mg·kg-1。注射组采用尾静脉注射,GH和GS的剂量均为20 mg·kg-1,故氨基葡萄糖实际给药量GH组为16.62 mg·kg-1,GS组为12.92 mg·kg-1。灌胃组大鼠给予GH或GS后,于5、15、30、45、60、120、240、360、480、600 min眼眶取血0.5 mL于肝素化离心管中。静脉注射组取血时间点为给药后0、2、5、8、15、30、45、60、120、240、480 min,全血2 500 r·min-1离心10 min,取血浆用于后续处理。
2.3 样本预处理取血浆150 μL,加入100 μL内标溶液,内标终浓度为96 μg·L-1。混匀,静置10 min,16 000 r·min-1离心10 min,收集上清液进样。
2.4 LC-MS/MS条件色谱条件:色谱柱Hedera ODS-3(4.6 mm×250 mm,5 μm),乙腈: 0.1%甲酸= 70 : 30,流速0.3 mL·min-1,柱温30 ℃,进样体积3 μL。
质谱条件:采用电喷雾离子源正离子扫描模式(ESI+);多反应监测扫描模式(MRM);碰撞气压力(CAD):Medium;气帘气压力(CUR):35 PSI;电喷雾电压(IS):4 500 V;离子源温度(TEM):550 ℃;雾化器压力(GS1):50 PSI;辅助气压力(GS2):50 PSI。氨基葡萄糖:m/z 180.10→162.20;碰撞能量(CE):9 eV;去簇电压(DP):41 eV。茶碱(内标):m/z 181.07→124.06;CE:25 eV;DP:26 eV。
2.5 数据分析所有时间点血药浓度测定值以均值表示,绘制血药浓度-时间曲线。用DAS 3.0软件进行数据处理,以非房室模型求出药代动力学参数。绝对生物利用度(F绝对)和相对生物利用度(F相对)计算公式如下[9-10]。
F绝对=(AUCig×Div)/(AUCiv×Dig)×100%,其中D为给予氨基葡萄糖的剂量,ig和iv分别为灌胃和注射给药。故本实验中FGH-absolute=(AUCig×16.62)/(AUCiv×103.86)×100%,FGS- absolute=(AUCig×12.92)/(AUCiv×80.78)×100%。
以GS为参比对照,根据Frelative=(AUCGH×DGS)/(AUCGS×DGH)×100%公式,本实验Fiv-relative=(AUCGH-iv×12.92)/(AUCGS-iv×16.62)×100%,Fig-relative=(AUCGH-ig×80.78)/(AUCGS-ig×103.86)×100%。
3 结果 3.1 方法学考查 3.1.1 专属性实验取大鼠空白血浆、含有对照品的血浆及给药后血浆3种血浆样品,按“2.3”项下预处理,观察内源性成分对氨基葡萄糖和内标的影响。如Fig 1所示,氨基葡萄糖和内标的保留时间分别为1.69 min和2.43 min。血浆中的内源性物质不干扰这两种化合物的测定,表明该方法专属性良好。
3.1.2 标准曲线的绘制取大鼠空白血浆,加入氨基葡萄糖储备液和内标溶液,使血浆中氨基葡萄糖终浓度为50、25、12.5、3.125、1.56、0.78、0.078、0.007 8 mg·L-1,混匀,静置10 min,16 000 r·min-1离心10 min,收集上清液进样。以血浆中氨基葡萄糖的提取离子流图(XIC)峰面积和内标的峰面积之比为横坐标(x),以氨基葡萄糖浓度为纵坐标(y)绘制标准曲线,确定线性范围。另外取血浆标准品溶液逐级稀释,以信噪比S/N=3和S/N=10时的浓度,分别作为最低检测限和最低定量限。氨基葡萄糖的回归方程为Y=0.620X+0.008,r=0.999。线性范围为0.007 8~50 mg·L-1,最低定量限为0.007 8 mg·L-1,最低检测限为0.000 78 mg·L-1。
3.1.3 提取回收率和基质效应取空白大鼠血浆,加入氨基葡萄糖储备液和内标溶液,配制成氨基葡萄糖终浓度为12.5、1.56、0.078 mg·L-1的质量控制(QC)样本,每个浓度平行制备5份样本,按“2.3”项下方法处理后进样分析,得目标分析物峰面积为A。另取空白血浆,除不加标准品和内标外,其余同“2.3”项下进行除蛋白和高速离心预处理,向上清液中加入GS和内标,使氨基葡萄糖浓度为12.5、1.56、0.078 mg·L-1,进样分析,得目标分析物峰面积为B。最后,利用流动相制备终浓度为以上3种浓度的氨基葡萄糖及内标的混合溶液,进样分析,得目标分析物峰面积为C。计算提取回收率=A/B×100%,考察基质效应=B/C×100%。结果显示,氨基葡萄糖提取回收率为89.1%~91.4%,基质回收率为99.3%~100.3%。内标提取回收率为89.5%,基质回收率为89.6%。
3.1.4 精密度和准确度参照标准曲线与定量范围,利用空白血浆配制3种不同浓度的QC样本。按“2.3”项下进行样品处理,在1 d内不同时间进样,计算日内精密度(RSD)和准确度(RE)。另外,在5日内进样,计算日间RSD和RE,结果见Tab 1。
Concentration/mg·L-1 | Intra-day | Inter-day | |||||
Found/mg·L-1 | RSD/% | RE/% | Found/mg·L-1 | RSD/% | RE/% | ||
12.5 | 12.63 | 5.65 | 1.06 | 12.60 | 2.96 | 0.80 | |
1.56 | 1.56 | 5.68 | 0.23 | 1.56 | 1.41 | 0.17 | |
0.078 | 0.075 | 3.62 | 4.36 | 0.073 | 4.67 | 6.15 |
对3种不同浓度的QC溶液在室温(20 ℃)24 h、-20 ℃冰冻30 d,以及反复冻融3次后,观察回收率。结果见Tab 2。
Concentration/mg·L-1 | Three freeze-thaw cycles | -20 ℃ for 30 d | 20 ℃ for 24 h | |||||
Found/mg·L-1 | Recovery/% | Found/mg·L-1 | Recovery/% | Found/mg·L-1 | Recovery/% | |||
12.5 | 12.67 | 101.4 | 11.87 | 94.9 | 11.85 | 94.8 | ||
1.56 | 1.58 | 101.4 | 1.57 | 100.8 | 1.57 | 100.4 | ||
0.078 | 0.076 | 97.4 | 0.076 | 97.4 | 0.078 | 100.0 |
大鼠经口服和注射给药后,GH和GS中氨基葡萄糖的平均血药浓度-时间曲线见Fig 2。采用DAS 3.0软件,以非房室模型统计分析其药代动力学参数,结果见Tab 3。
Parameter | GH/iv | GH/ig | GS/iv | GS/ig |
AUC(0-t)/μg·L-1·min-1 | 231.55±77.66 | 194.89±53.73 | 139.73±19.01 | 106.50±20.44 |
AUC(0-∞)/μg·L-1·min-1 | 236.64±75.36 | 202.22±55.25 | 142.08±19.08 | 108.71±19.89 |
MRT(0-t)/min | 56.10±16.40 | 176.24±10.99 | 44.35±14.30 | 153.60±11.73 |
MRT(0-∞)/min | 74.35±28.13 | 199.96±23.24 | 55.27±11.27 | 167.41±10.26 |
116.37±75.19 | 118.82±52.02 | 127.17±45.56 | 114.82±29.09 | |
Tmax/min | 0.00±0.00 | 87.50±36.02 | 0.00±0.00 | 77.50±33.43 |
Cmax/μg·L-1 | 10.81±3.04 | 0.87±0.20 | 8.90±0.96 | 0.71±0.11 |
Fabsolute(0-t)/% | - | 14.17±3.79 | - | 12.55±3.75 |
Fabsolute (0-∞)/% | - | 14.33±3.90 | - | 12.57±3.61 |
Frelative(0-t) /% | 131.77±50.87 | 149.14±54.17 | - | - |
Frelative (0-∞)/% | 132.65±50.46 | 150.60±51.89 | - | - |
在优化质谱参数的过程中,氨基葡萄糖起初选用和文献报道一样的离子碎片(m/z 180.10→72)[11],但结果发现子离子响应较差(检测限约为5 μg·L-1),而子离子采用162.20后,灵敏度明显提高,检测限达到目前的0.78 μg·L-1,且稳定性很好。本次实验采用的UFLC-MS/MS方法,质谱电喷雾电离源(ESI+)将样品离子化,多反应离子监测(MRM)准分子离子峰,具有选择性好、灵敏度高、分析时间短等优点,能够迅速、灵敏地检测氨基葡萄糖的血药浓度。
根据国内外研究报道,大鼠口服剂量选用125 mg·kg-1,针对关节损伤动物的改善效果最为明显,故本次实验选用该剂量为受试剂量[12-13]。从药动学参数可以发现,GH和GS中的氨基葡萄糖
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