2. 安徽中医药大学 药物代谢动力学研究室,安徽 合肥 230031;
3. 江苏省中医药研究院细胞与分子生物学实验室,江苏 南京 210028
2. Lab of Drug Metabolism and Pharmacokinetics, Anhui University of Chinese Medicine, Hefei 230031, China;
3. Lab of Cellular and Molecular Biology, Jiangsu Province Institute of Traditional Chinese Medicine, Nanjing 210028, China
多药耐药相关蛋白1 (multidrug resistance-associated protein 1, MRP1)是一种依赖于ATP介导的底物跨膜转运蛋白,在肺部炎症反应、氧化应激、毒性物质解毒等方面发挥着积极的作用,并在慢性阻塞性肺疾病(chronic obstructive pulmonary disease, COPD)发病过程中起着保护作用[1-2]。NF-E2相关因子2 (NF-E2-related factor 2, Nrf2)是一种氧化还原敏感的碱性亮氨酸拉链蛋白转录因子,参与多种解毒和抗氧化基因的调控[3]。以往大量研究表明,MRP1、Nrf2在COPD患者肺组织中的表达明显降低[4-5]。然而,近期研究发现,轻度稳定期COPD患者仍可以通过激活Nrf2/ARE来抵御细胞内活性氧(reactive oxygen species, ROS)[6],但MRP1蛋白的表达是否也呈现这种趋势尚未可知。本实验通过对野生型(wide type, WT)及Nrf2敲除型(-/-) C57BL/JNju小鼠建立轻度稳定期COPD模型,研究轻度稳定期COPD疾病状态下,Nrf2信号通路的作用特点及其对MRP1蛋白表达的影响,探讨Nrf2/MRP1系统对肺组织的保护作用,验证机体通过上调Nrf2及其靶基因的能力是否也可能是决定COPD严重程度和进展的关键指标,旨在为COPD的预防及早期治疗提供理论参考。
1 材料与方法 1.1 实验动物SPF级C57BL/JNju野生型♂小鼠和Nrf2基因敲除型♂小鼠,体质量16~22 g。C57BL/JNju野生型小鼠购自南京大学南京生物医药研究院,合格证号:SCXK (苏) 201701627。于安徽中医药大学实验动物中心内饲养1周,温度(25±2)℃、相对湿度(55±10)%。Nrf2基因敲除小鼠由江苏省中医药研究院提供(Johns Hopkins University引进),在安徽中医药大学动物中心繁殖扩群。本实验中所涉及到的实验动物均符合伦理委员会的相关规定。
1.2 试剂黄山牌香烟购自安徽中烟工业有限责任公司(香烟焦油量:1 mg,烟气烟碱量:1.1 mg);DAB显色试剂、GAPDH抗体,购自北京中杉金桥生物技术有限公司;BCA蛋白定量试剂盒购自碧云天生物技术研究所;Nrf2抗体、血红素加氧酶-1(heme oxygenase-1, HO-1)抗体,购自美国Santa Cruz公司;MRP1抗体购自英国Abcam公司;ECL超敏发光试剂盒购自美国Pierce公司。
1.3 方法 1.3.1 轻度稳定期COPD小鼠模型的建立据文献考察,烟熏4周~6个月均可诱导小鼠成为COPD模型[7],但病程如:肺功能、肺泡细胞损伤及凋亡、炎症细胞数量等会随着烟熏时间的增长而改变[8]。烟熏4周[9],通常可以达到符合疾病明显病变特点的程度,但研究药物干预作用的COPD模型则需经过更长时间的暴露刺激。本实验目的是探究疾病初期的病理机制特点,所以采用烟熏4周建立轻度稳定期COPD小鼠模型。♂C57BL/JNju WT小鼠20只,♂Nrf2-/-小鼠20只,按照随机分组的原则分为:A(WT正常组)、B(WT模型组)、C(Nrf2-/-正常组)、D(Nrf2-/-模型组)共4组,每组10只。将B、D组小鼠放入自制的烟熏缸中(体积100 cm×100 cm×100 cm,侧壁有2 cm直径的通气孔,以此来保持缸内气压的稳定),让小鼠被动吸烟,1次15支香烟,每次持续约1 h,每天烟熏4次,每次间隔大于30 min,连续4周。
1.3.2 小鼠呼吸功能的测定将小鼠以3.5%的水合氯醛(10 mL·kg-1)腹腔注射注射麻醉后,用手术刀切开气管插管,将其仰卧于动物呼吸机的密闭体描箱内,测定其肺功能。主要的检测指标包括FEV0.1、FEV0.3/FVC%、PEF、FEF25-75、顺应性(Cdyn)。
1.3.3 标本收集小鼠肺功能测定后,迅速取出左肺组织,固定于4%多聚甲醛中,用于肺部组织病理学变化、免疫组化检测。其右肺组织立即放入液氮罐中保存,后放入-80 ℃冻存,用于Western blot检测。
1.3.4 肺组织病理学检查取小鼠的左肺组织用4%多聚甲醛固定,进行脱水、透明、浸蜡、包埋,切片(厚5 μm)。采用HE染色、中性树胶封片,光镜下观察染色结果。
1.3.5 免疫组化检测取小鼠左肺组织石蜡切片(5 μm),分别滴加Nrf2及MRP1一抗,4 ℃孵育过夜,滴加二抗生物素化山羊抗兔液,DAB显色,苏木精复染细胞核。用乙醇逐步脱水,中性树胶封片,显微镜观察。
1.3.6 Western blot检测将右肺组织剪碎,加入裂解液,匀浆后,离心10 min,分离上清液,在562 nm波长下,检测蛋白浓度。配制SDS-PAGE胶,每个胶孔上10 μL的蛋白,电泳后,切下目标蛋白范围内的凝胶,然后将蛋白转移到NC膜上,用5%脱脂奶封闭2 h后,PBS-T缓冲液洗脱3次,每次3 min。随后加入稀释到相应倍数的一抗,4 ℃孵育,孵育完成,PBS-T洗脱3次,每次3 min。加入二抗孵育2 h后,PBS-T洗脱3次,每次5~8 min,用ECL显色后,凝胶成像仪曝光显影。
1.3.7 统计学方法用SPSS 17.0统计学软件进行统计分析,实验数据均采用x±s表示。两组间数据比较采用独立样本t检验分析,多组间数据比较采用单因素方差分析(one-way ANOVA)。
2 结果 2.1 造模后Nrf2、HO-1、MRP1在WT小鼠肺组织中的表达明显上升Fig 1为烟熏前后WT小鼠的肺组织中Nrf2、HO-1、MRP1蛋白条带图,选择GAPDH蛋白作为实验内参。利用Quantity One软件对电泳条带进行灰度值分析,结果表明,与WT正常组相比,烟熏4周后,MRP1、Nrf2在WT模型组中的表达明显增多(P < 0.01),说明模型组小鼠仍然具有上调Nrf2与MRP1表达来抵御氧化应激以及外源性异物损伤的能力,并且两个蛋白的表达趋势一致。为了进一步探究Nrf2的蛋白表达情况及Nrf2的转录活性,实验同时检测了Nrf2转录激活产物HO-1的表达情况。结果显示,WT模型组中HO-1的表达较WT正常组明显上升(P < 0.01),说明Nrf2在蛋白水平上被激活,转录活性增强。
2.2 各肺功能指标检测均符合慢性支气管炎和阻塞性肺气肿的病理学特征肺功能是评价COPD模型建立的重要评价标准之一,FEV0.1、FEV0.3/FVC%是检测气流受限的敏感指标,PEF、FEF25-75、Cydn对小气道气流受限敏感性较高,可较好地反映小气道功能。Tab 1结果显示,WT模型组小鼠和Nrf2-/-模型组小鼠分别与WT正常组和Nrf2-/-正常组相比,FEV0.3/FVC%、FEV0.1、PEF、FEF25-75、Cydn均明显降低(P < 0.01或P < 0.05),符合慢性支气管炎和阻塞性肺气肿的病理学特征,并且与WT模型组相比,以上各指标在Nrf2-/-模型组中的改变趋势更为明显(P < 0.05)。
Group | FEV0.3/FVC% | FEV0.1 | PEF | FEF25-75 | Cydn |
WT normal | 0.920±0.036 | 0.819±0.035 | 3.984±1.057 | 7.682±0.310 | 0.335±0.090 |
WT model | 0.686±0.188# | 0.712±0.302# | 2.605±0.729# | 6.812±0.523# | 0.225±0.137# |
Nrf2-/- normal | 0.931±0.049 | 0.805±0.028 | 3.240±1.148 | 7.962±0.252 | 0.324±0.016 |
Nrf2-/- model | 0.625±0.242**△ | 0.634±0.048**△ | 1.886±0.822*△ | 6.204±0.311**△ | 0.166±0.015**△ |
#P < 0.05 vs WT normal; *P < 0.05, **P < 0.01 vs Nrf2-/- normal; △P < 0.05 vs WT model |
如Fig 2所示,WT正常组及Nrf2-/-正常组小鼠肺泡大小均匀,结构清晰,气道黏膜上皮结构完整,纤毛排列整齐。WT模型组及Nrf2-/-模型组小鼠肺泡腔不规则扩大,部分形成肺大泡,肺间质内可见不同程度的炎细胞浸润,并且在Nrf2-/-模型组小鼠中更为明显。同时,Nrf2-/-模型小鼠肺泡毛细血管广泛受损,肺泡内可见大量红细胞,这些病理改变造成气道狭窄,引起固定性气道阻塞,符合COPD的特征性病理改变。
2.4 Nrf2基因敲除抑制了香烟烟雾诱导小鼠肺组织中MRP1蛋白表达的上调Fig 3免疫组化结果显示,Nrf2、MRP1的蛋白表达主要位于肺支气管上皮细胞及肺泡间隙中。通过软件计算积分光密度值后,与WT正常小鼠相比,WT模型组小鼠肺组织中Nrf2、MRP1的表达明显增多(P < 0.05),呈强阳性表达。而Nrf2-/-正常组及模型组中MRP1的表达均明显降低,但两组之间的变化不具有统计学意义(P>0.05)。提示香烟烟雾刺激可以提高小鼠肺中MRP1的蛋白水平,而在Nrf2敲除小鼠体内这一作用则被抑制。
2.5 香烟烟雾所致轻度稳定期COPD小鼠肺组织中MRP1表达增加可能与Nrf2信号通路有关如Fig 4所示,与WT正常组相比,MRP1在Nrf2-/-正常组中的表达明显降低(P < 0.01),说明MRP1蛋白在小鼠肺组织的表达主要依赖于Nrf2;同时,香烟烟熏后与Nrf2-/-正常组相比,MRP1在Nrf2-/-模型组中的表达并未发生明显改变(P>0.05)。结合“2.1”的实验结果,进一步说明在轻度稳定期COPD状态下,Nrf2信号通路被激活,MRP1蛋白的表达上调,并且MRP1的上调可能与Nrf2信号通路的激活有关。
3 讨论COPD是一种能够治疗和预防的常见肺部疾病,以持续的气流受限为特征,其气流受限的特征多呈进展性。参照GOLD分级,COPD可分为轻度、中度、重度和极重度4个等级,不同程度的COPD具有不同的病理特征及发病机制。在过去的几十年里,这一问题的研究主要集中在重度COPD上,然而,有关于气道阻塞不太严重的轻度COPD的研究数据极其缺乏。本实验通过被动烟吸法建立轻度稳定期COPD小鼠模型,探讨Nrf2信号通路对轻度COPD小鼠肺支气管上皮细胞中MRP1表达的影响,期望为COPD的预防及早期治疗提供理论参考。
Nrf2作为核转录激活因子,是机体细胞氧化应激反应的重要调节器,在氧化应激反应中处于核心位置,并在COPD的发生、发展过程中发挥着重要的作用[10]。以往大量研究显示,吸烟者的巨噬细胞、COPD患者的整个肺组织中Nrf2表达均下降,并且严重肺气肿患者肺巨噬细胞中HO-1的表达也降低[5]。然而,近期研究结果表明,轻度稳定期COPD患者仍然可以通过上调Nrf2/ARE的表达,来抵御细胞内ROS,但在重度COPD患者中,这条通路则被抑制[6]。田戈等[11]研究也发现,香烟烟雾刺激诱导的COPD模型小鼠,ROS的增加会刺激机体产生氧化应激反应,从而激活Nrf2核转录,上调GSH合成限速酶γ-GCS的表达,使GSH的合成增加,参加局部抗氧化作用。由此可以推测,在COPD不同病程时期,患者体内参与病理生理特征的分子机制具有明显差异,机体通过上调Nrf2及其靶基因的能力可能是决定COPD严重程度和进展的关键指标之一。因此,深入了解疾病的进程对预防COPD的发生以及抑制COPD的发展具有重要意义。本实验通过4周香烟烟雾烟熏刺激,建立轻度稳定期COPD小鼠模型[9],对肺功能及HE染色结果分析发现,Nrf2的缺失加重了香烟烟雾刺激所致的COPD;免疫组化及Western blot结果显示,与WT正常组相比,Nrf2及其靶基因HO-1在WT模型组中的表达明显上升,这一结果与上述文献的描述相吻合。
MRP1位于多种极性细胞膜表面,是一种依赖ATP介导其底物自细胞内转运至细胞外的一种膜糖蛋白,属于ABC超家族中的重要一员[12]。MRP1作为两性有机阴离子转运载体,主要介导化学异物、外源性有毒物质等的外排,以及氧化型谷胱甘肽(GSSG)、内源性物质炎症介质白三烯C4等的跨膜转运。因此,MRP1在肺部氧化应激反应、炎症反应、毒性物质解毒方面,以及保护机体免受化学致癌物质侵袭等方面,发挥着重要作用[1]。近年来研究发现,Nrf2信号通路不仅参与调控Ⅱ相解毒酶的表达,同时也参与了转运体MRPs的表达调控。有证据表明,Nrf2参与了MRP1在人类骨髓性白血病细胞中的表达,当抑制Nrf2-ARE通路时,MRP1的表达下降[13]。与WT小鼠相比,当使用Nrf2的激活剂作用于Nrf2缺失型小鼠后,可以诱导其肝脏组织中MRP2、MRP3、MRP4的表达[14]。同时,在线粒体基因组缺失的肝细胞中,由于其产生ROS的能力下降,Nrf2的核转位会受到影响,从而可以部分下调对乙酰氨基酚和胆汁酸对肝细胞中MRP1和MRP4的诱导作用[15]。由此我们推测,轻度稳定期COPD小鼠肺组织中MRP1的表达可能也受到Nrf2信号通路的调控。通过免疫组化实验可知,与WT正常小鼠相比,WT COPD小鼠肺组织中MRP1的表达明显增多,呈强阳性表达。而Nrf2-/-正常组及模型组MRP1的表达均明显降低,提示香烟烟雾刺激可以提高小鼠肺中MRP1的蛋白水平,而在Nrf2敲除小鼠体内,这一机制则被抑制。同样,Western blot结果显示,与WT正常组相比,MRP1在WT模型组中的表达明显增多,并且与Nrf2蛋白的表达趋势具有一致性。为了进一步探究Nrf2的蛋白表达情况及Nrf2的转录活性,本实验检测了Nrf2转录激活产物HO-1蛋白的表达情况。结果显示,WT模型组中HO-1的表达较WT正常组明显上升,说明Nrf2在蛋白水平上被激活,转录活性增强。同时,MRP1在Nrf2-/-正常组中的表达较WT正常组明显降低;香烟烟熏后,与Nrf2-/-正常组相比,MRP1在Nrf2-/-模型组中的表达并未发生明显改变,进一步说明MRP1在小鼠肺组织中的表达可能是受Nrf2信号通路的调控。
综上所述,烟雾所致轻度稳定期COPD小鼠肺组织中MRP1表达的增加与Nrf2信号通路有关,因此,机体通过上调Nrf2及其靶基因的能力,也有可能是决定COPD严重程度和进展的关键指标。目前,还没有能够明显逆转COPD进展的治疗方法,未来可以通过关注疾病进程,抑制COPD患者中Nrf2及MRP1的下降,从而减轻由氧化应激、炎症反应等因素给疾病进展带来的负面影响。
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