玉米须作为我国传统中药材之一,为禾本科植物玉米(Stigma maydis L.)的花柱和柱头。《中华人民共和国药典》中记载:玉米须味甘、淡、平,归膀胱、肝、胆经,具有利湿退黄、降压、利尿消肿等功效[1]。现代药理学研究表明,玉米须具有降血糖、利尿、降血脂、抗炎、提高免疫力等功效[2]。
糖尿病(diabetes mellitus, DM)的主要发病类型是Ⅱ型糖尿病(type 2 diabetes mellitus, T2DM),它除了持久性高血糖外,常伴随着脂肪、蛋白质代谢等代谢紊乱,也称“代谢综合征”,因此,DM患者容易发生感染、肾功能衰竭等并发症,给人们的健康带来严重的威胁[3]。代谢组学是一项多参数应答的、动态的新技术,主要利用现代分析技术定量测定生物体内源性小分子代谢产物,考察生物体在不同状态下代谢产物的变化,通过整体分析代谢图谱并结合模式分析,获得相对应的生物标记物群,揭示了在特定环境下生物体的整体功能状态[4]。
玉米须治疗T2DM主要集中在某类成分降糖作用等方面的研究,但关于玉米须干预T2DM相关代谢组学研究尚未见报道。因此,本文通过建立T2DM大鼠模型,结合UPLC/Q-TOF-MS技术和多元统计比较分析方法,对玉米须治疗前后T2DM大鼠尿液代谢产物进行分析鉴定,初步阐明玉米须治疗T2DM的作用机制。
1 材料 1.1 试剂链脲佐菌素(streptozocin,STZ)(批号:S0130,美国Sigma公司);柠檬酸、柠檬酸钠(分析级,西陇科学股份有限公司);甲醇、乙腈(色谱级,Merck公司);甲酸(色谱级,Fisher公司);蒸馏水(广州屈臣氏食品饮料有限公司)。
1.2 试药玉米须药材于2017年9月采自黑龙江省农业科学院齐齐哈尔分院,经王伟明研究员(黑龙江省中医药科学院)鉴定为玉米须(Stigma maydis L.)。玉米须采用水煎煮方法提取浓缩,将干燥的玉米须剪短至2~3 cm,浸泡2 h,加10倍水煎煮2次,每次3 h,过滤,合并两次滤液,于80 ℃水浴锅中浓缩,冷却后置于-20 ℃冰箱中待用,临用时,加适量蒸馏水配成0.54 kg·L-1的溶液。
1.3 实验动物SPF级♂Wistar大鼠,体质量(200±20)g,由辽宁长生生物技术有限公司提供,动物许可证号:SCXK(辽)2015-0001。高糖高脂饲料,购于北京科奥协力饲料有限公司。大鼠饲养于黑龙江省中医药科学院动物实验中心,自由取食、饮水,每天给予光照12 h,进行1周的适应性饲养后,开始实验操作。
1.4 仪器Exion LCTMUPLC超高效液相色谱系统、Triple TOF 5600+型质谱系统(配有ESI源及APCI源)(美国AB SCIEX公司);BSA224S-CW型分析天平(赛多利斯科学仪器北京有限公司);IVC-Ⅱ型代谢笼(苏州市冯化实验动物设备有限公司);ST16R型低温高速离心机(美国Thermofisher Scientific公司);MDF-382E9(N)型超低温冰箱(日本SANYO公司);罗氏卓越型血糖仪及配套血糖试纸(美国罗氏诊断产品有限公司)。
2 方法 2.1 动物造模及给药参考文献[3],将Wistar♂大鼠42只,随机分成空白组14只、模型组28只。空白组大鼠喂养基础饲料,模型组大鼠给予高糖高脂饲料,喂养4周后,所有大鼠禁食16 h,模型组按35 mg·kg-1单次腹腔注射STZ,空白组则腹腔注射柠檬酸缓冲液。72 h后尾静脉取血测定血糖,选取空腹血糖值大于16.7 mmol·L-1且持续1周不变者作为T2DM模型大鼠,不成模大鼠弃之。符合糖尿病模型的大鼠有20只,将其按血糖、体质量随机分组,分为模型对照组(10只)和玉米须给药组(10只),空白对照组和模型对照组灌胃蒸馏水,给药组灌胃玉米须提取物,给药剂量根据玉米须临床用量[5],以2倍剂量换算成大鼠(200 g)的剂量是10.8 g·kg-1。连续给药4周。
2.2 血糖检测造模成功后,每两周为1个周期,所有大鼠禁食不禁水12 h,使用血糖仪及配套试纸测尾静脉空腹血糖值。
2.3 样本采集和预处理给药4周后,大鼠代谢笼收集12 h尿液。在此期间大鼠禁食不禁水。收集的尿液4 ℃、13 000 r·min-1离心10 min后,吸取上清液,后置于-80 ℃冰箱中保存备用,分析前解冻。
2.3.1 尿液的质控样本取所有大鼠尿样各200 μL,混匀,作为质控(quality control,QC)尿液样品。取QC尿液样品800 μL,分别加入800 μL水溶液稀释至2倍,涡旋1 min,0.22 μm滤膜过滤,取续滤液进样。
2.3.2 尿液样本取大鼠尿样各800 μL,分别加入800 μL水溶液稀释至2倍,涡旋1 min,0.22 μm滤膜过滤,取续滤液进样。
2.4 尿液分析的色谱和质谱条件 2.4.1 色谱条件Waters Acquity UPLC HSS T3 C18色谱柱(1.7 μm, 2.1 mm×100 mm),AQUITY UPLC HSS T3 C18 VanGuard Pre-Column预柱(1.7 μm, 2.1 mm×5 mm),柱温30 ℃。进样量5 μL,自动进样器温度设为4 ℃,流速0.3 mL·min-1。流动相梯度洗脱见Tab 1。
Time/min | 1‰ formic acid water/% | 1‰ formic acid acetonitrile/% |
0 | 95 | 5 |
3 | 90 | 10 |
9 | 70 | 30 |
14 | 0 | 100 |
15 | 0 | 100 |
15.1 | 95 | 5 |
16 | 95 | 5 |
采用电喷雾离子源(ESI),正、负离子模式采集数据,质谱参数设定见Tab 2。扫描方式:IDA,响应值在100 cps以上的8个最高峰进行二级质谱扫描,并扣除动态背景(DBS)。数据采集软件是Analyst TF 1.6 software工作站。
Ion mode | ESI+ | ESI- |
ISVF | 5 500 V | -4 500 V |
TEM | 550 ℃ | 550 ℃ |
CUR | 35 psi | 35 psi |
Gas1 | 55 psi | 55 psi |
Gas2 | 55 psi | 55 psi |
DP | 80 V | -80 V |
TOF MS CE | 10 eV | -10 eV |
Production ion CE | 35 eV | -35 eV |
CES | 15 eV | -15 eV |
TOF MS ion scan range | 80~1 200 Da | 80~1 200 Da |
Production ion scan range | 50~1 200 Da | 50~1 200 Da |
采用SPSS 17.0软件对血糖值和体质量进行单因素方差分析(F检验)。数据以x±s表示,组间差异采用t检验。将UPLC/Q-TOF-MS采集得到的数据导入Waters Progenisis QI软件进行峰匹配、峰提取等,再将数据导入EZinfo软件,对各组数据进行主成分分析(PCA)和正交偏最小二乘法-判别分析(OPLS/PLS-DA),选VIP值>1和t检验中P值< 0.05以及Fold Change≥2,来找到差异性代谢物。通过HMDB、KEGG等数据库的检索,对代谢物进行结构鉴定,找到相应的代谢途径,并结合相关文献及分子生物学知识,探讨潜在生物标志物的生物学意义。
3 结果 3.1 大鼠一般观察造模后的大鼠出现活动减少、体毛疏松现象,饮食量和饮水量、尿量明显增加,而体质量明显减轻(P < 0.01),出现明显的“三多一少”症状。空白组大鼠体质量持续增加,模型鼠体质量降低,经过玉米须给药治疗后,这些症状得到了明显的改善,并且体质量出现了逐步增加的现象。见Tab 3。
Group | 0 week | After modeling | Two weeks after dosing | Four weeks after dosing |
Blank | 222±10 | 489±29 | 527±28 | 576±30 |
Model | 223±8 | 400±28## | 404±26## | 431±29## |
Corn | 222±9 | 404±28 | 429±26* | 429±28 |
##P < 0.01 vs blank control; *P < 0.05 vs model |
Tab 4结果显示,大鼠造模后,与空白对照组相比,模型组空腹血糖值明显升高(P < 0.01);与模型组相比,给药2周后,玉米须给药组大鼠血糖值明显降低(P < 0.01)。
Group | 0 week | After modeling | Two weeks after dosing | Four weeks after dosing |
Blank | 4.9±0.6 | 6.7±0.4 | 5.6±0.5 | 5.5±0.4 |
Model | 4.9±0.7 | 28.8±2.3## | 28.9±2.5## | 28.1±2.6## |
Corn | 4.9±0.7 | 27.8±2.6## | 23.8±3.0** | 17.7±3.5** |
##P < 0.01 vs blank control; **P < 0.01 vs model |
为确保保留时间(tR)和质荷比(m/z)的稳定性等,在UPLC/Q-TOF-MS检测过程中,每检测8个样本,选择进1次QC样本。Fig 1是正负离子模式下系统稳定性检测的结果,QC样本聚类明显。结果表明,系统在检测过程中很稳定,所得到的数据可靠。
3.3.2 大鼠尿液代谢轮廓分析为了考察玉米须水煎液对T2DM模型大鼠内源性代谢物的影响,将UPLC/Q-TOF-MS采集的所有尿液样品数据导入Waters Progenisis QI软件进行PCA分析(Fig 1)。由图可知,空白对照组、模型组及玉米须给药组组内聚类较好,组间有明显的离散,说明经玉米须干预后,玉米须给药组对模型组有干扰作用。
为了进一步区分各组差异,对空白对照组、模型组和玉米须给药组尿液代谢物进行有监督的PLS-DA分析,其中正离子模式下模型的评价指标为R2X=0.96,Q2=0.86,负离子模式下模型的评价指标为R2X=0.98,Q2=0.94,见Fig 2。结果显示,所建立的模型有效,模式质量良好,可用于后续的组间差异成分的寻找与分析,并且模型组与给药组有明显的分开。
3.3.3 潜在生物标志物的表征采用正交偏最小二乘判别分析(OPLS-DA)方法,对空白对照组、模型组及模型组、玉米须给药组大鼠尿液代谢轮廓数据分别进行分析(Fig 3、4),获得能够直观反映对代谢轮廓轨迹变化贡献率的S-Plot(Fig 5、6)。在S-Plot中,依据载荷图中距离原点越远,离子对代谢轮廓轨迹产生变化的贡献越大。将变量重要投影值(VIP>1)、t检验(P < 0.05)以及Fold Change≥2的代谢物视为差异性代谢物,查阅相应的数据库(KEGG/HMDB),结合质谱信息对选出的差异性代谢物进行鉴定、识别。在正、负离子模式下,分别筛选出6个和6个差异性标志物。见Tab 5、6。
No. | Potential biomarker | tR/min | m/z | Molecular formula | Trend(change multiplier) | |
A | B | |||||
1 | L-Proline | 2.39 | 116.069 3 | C5H9NO2 | 8.43↑## | 3.21↓** |
2 | Adenosine monophosphate | 4.68 | 348.069 7 | C10H14N5O7P | 3.66↓## | 3.56↑** |
3 | N-Acetyl-D-glucosamine | 5.62 | 222.097 3 | C8H15NO6 | 9.23↑## | 5.63↓** |
4 | 4, 6-Dihydroxyquinoline | 8.16 | 162.053 6 | C9H7NO2 | 6.77↓## | 4.91↑** |
5 | Argininosuccinic acid | 8.66 | 291.132 8 | C10H18N4O6 | 4.99↑## | 2.64↓** |
6 | Leukotriene B4 | 11.42 | 337.236 9 | C20H32O4 | 3.19↓## | 1.78↑** |
##P < 0.01 vs blank control group A; **P < 0.01 vs model group B.↓: decrease; ↑: increase. The same as below. |
No. | Potential biomarker | tR/min | m/z | Molecular formula | Trend(change multiplier) | |
A | B | |||||
1 | Alpha-lactose | 1.18 | 341.109 4 | C12H22O11 | 6.29↑## | 2.42↓** |
2 | Lactic acid | 1.44 | 89.025 2 | C3H6O3 | 3.12↑## | 1.93↓** |
3 | (R)-3-Hydroxybutyric acid | 2.45 | 103.040 9 | C4H8O3 | 9.43↑## | 3.24↓** |
4 | 5-Hydroxyindoleacetic acid | 7.35 | 190.050 8 | C10H9NO3 | 2.62↑## | 2.51↓** |
5 | Glycocholic acid | 11.44 | 464.302 7 | C26H43NO6 | 4.83↑## | 1.60↓* |
6 | Chenodeoxycholic acid | 12.72 | 391.286 2 | C24H40O4 | 1.47↑# | 1.43↓* |
#P < 0.05,##P < 0.01 vs blank control group A; *P < 0.05,**P < 0.01 vs model group B |
由Tab 5、6可见,在12个核心标志物中,模型组含量均与空白对照组差异有显著性,给药后,均有回调趋势。将正负离子模式下得到潜在生物标志物导入到Human Metabolome Database(HMDB)和Kegg Compound Database(KEGG)数据库中,对这12个标志物可能的代谢通路进行分析。
3.4.1 氨基酸代谢生物体内大部分胆固醇(75%~85%)可在肝脏转变鹅去氧胆酸(chenodeoxycholic acid)和甘氨胆酸(glycocholic acid),鹅去氧胆酸和胆酸分别与甘氨酸或牛磺酸结合,生成初级结合胆汁酸。胆汁酸随胆汁分泌进入小肠,大部分被肠黏膜重吸收,经门静脉返回肝脏,再排泄至肠道,即胆汁酸的“肠肝循环”,其中只有少部分随粪便排出体外。所以正常情况下,尿液中含有少量胆汁酸,若肠肝循环被破坏,血清中的胆汁酸含量就会明显升高,而此时生成胆汁酸的限速酶下降至15倍,尿液中胆汁酸含量就会增加。本实验结果发现,鹅去氧胆酸和甘氨胆酸含量在T2DM模型组中明显升高(P < 0.05),而在玉米须给药组中明显降低(P < 0.05),较模型组分别降低15.54%和16.01%。这主要是因为T2DM模型鼠体内血糖含量过高,使糖代谢和脂代谢发生异常,肝脏摄取胆汁酸功能发生障碍,胆固醇在肝内转化率下降并蓄积,使肠肝循环受到破坏,尿中的甘氨胆酸和鹅去氧胆酸含量明显升高,而玉米须可使糖代谢及脂代谢趋于正常[6]。
色氨酸代谢与免疫调节功能及机体神经内分泌有密切关系,可能与DM发生有关[7]。5-羟基吲哚乙酸(5-hydroxyindoleacetic acid,5-HIAA)是5-羟色胺(5-HT)的主要代谢产物。而5-HT是由体内色氨酸经羟化和脱羧作用生成,其中未被利用的5-HT经单胺氧化酶转化为5-HIAA,从尿液排出体外,同时4, 6-二羟基喹啉(4, 6-dihydroxyquinoline)也是色氨酸代谢产物之一。实验发现,T2DM鼠尿液中5-HIAA含量明显升高(P < 0.01),4, 6-二羟基喹啉含量明显降低(P < 0.01),表明大鼠体内发生了色氨酸代谢紊乱。而玉米须给药组大鼠尿液中5-HIAA含量明显降低(P < 0.01),4, 6-二羟基喹啉含量明显升高(P < 0.01),表明玉米须可以改善色氨酸代谢。
3.4.2 糖代谢乳酸(lactic acid)大部分是由肌肉糖酵解生成的,经血液运输到肾脏或肝脏,再经过糖异生形成葡萄糖。安静的状态下产生的乳酸的量很少,只有在某些生理或病理状态下,肌糖原酵解产生大量的乳酸,由血液运输到肝脏,形成葡萄糖。在模型鼠中,乳糖(lactose)、乳酸含量明显升高(P < 0.01),推测原因可能与糖酵解有关。正常生理条件下,糖异生的主要器官是肝脏,当肝脏受到损伤,乳酸代谢发生障碍,导致乳酸堆积,最终使尿中乳酸含量升高[8],而经玉米须治疗后,发现乳糖、乳酸含量明显降低(P < 0.01),提示玉米须可以通过保护肝脏来降低血糖。
精氨琥珀酸(argininosuccinic acid)是由精氨酸代琥珀酸裂解酶催化裂解为延胡索酸和精氨酸,生成的延胡索酸再进入TCA循环中,而TCA循环是糖、脂和氨基酸的最终代谢通路。模型鼠中精氨琥珀酸含量异常升高可能是精氨酸代琥珀酸裂解酶下调所致,表明可能因为缺乏底物参与而使TCA循环减弱。经过玉米须治疗后,大鼠尿液中的精氨琥珀酸含量明显下降(P < 0.01),较模型组下降了62.24%,说明玉米须可能参与了TCA循环[9]。
3.4.3 其他酮体(丙酮、β-羟丁酸、乙酰乙酸)是脂肪酸在肝脏分解氧化时所特有的中间代谢产物。正常情况下,糖的氧化是生物体主要的能量来源,此时脂肪动员较少,因而血中酮体含量也很少(约在0.05~0.85 mmol·L-1)。但当血中含糖量过高,糖氧化供能降低,脂肪酸转化为大量的酮体,超过肝外组织利用分解酮体的能力,血中和尿中出现大量酮体。本实验结果发现,T2DM模型组尿液中(R)-3-羟基丁酸[(R)-3-hydroxybutyric acid]含量明显升高(P < 0.05),而玉米须给药组含量则明显降低(P < 0.05)。这可能与玉米须调节酮体生成有关[10]。
白三烯是花生四烯酸(arachidonic acid,AA)通过脂质氧化酶途径产生的重要产物之一,AA通过脂氧化酶代谢为氧化二十烯酸(5-HPETE),在水解酶或谷胱甘肽-5-转移酶(GST)的作用下,转为二羟酸LTB4[11]。GST酶被证实可以通过结合氧化物质底物,从而保护细胞避免氧化损伤[12]。故有研究表明,谷胱甘肽S-转移酶M1(GSTM1)基因缺失易发生DM[13]。同时,DM也被认为是全身炎症性疾病[14],而白三烯B4(leukotriene B4,LTB4)是体内重要的炎症调节因子。本实验结果发现,模型鼠尿液中LTB4含量明显降低(P < 0.01),玉米须给药组LTB4水平明显升高(P < 0.01),可能原因是玉米须水煎液可以增强GST转移酶活性,抗氧化活力增强,LTB4生成量增加,产生抗炎作用,提示玉米须水煎液具有抗氧化和抗炎作用。
4 讨论DM是一种常见的受多种因素影响,且具有遗传倾向的内分泌代谢性疾病,以血糖升高为主要表现,并伴随糖、脂、能量、氨基酸等代谢紊乱,以及氧化应激状态,从而对肝肾功能有一定的损伤[15]。代谢组学能将内源性小分子代谢物相关信息与疾病的生理病理状态联系起来,从整体揭示内分泌代谢性疾病(如糖尿病)的发病机制,并能体现中药多靶点综合性作用特点。因此,利用代谢组学方法研究中药治疗T2DM及其并发症的研究已成为研究热点。本实验结果发现,玉米须水煎液能明显改善DM“三多一少”的临床症状,对体质量的改善尤为明显,并可以明显降低T2DM大鼠的血糖值。通过将尿液代谢谱进行多元统计分析,发现模型组大鼠糖代谢、脂肪代谢、氨基酸代谢等多条代谢途径发生紊乱,玉米须对这些代谢途径中chenodeoxycholic acid、5-HIAA、(R)-3-hydroxybutyric acid、argininosuccinic acid、arachidonic acid、4, 6-dihydroxyquinoline、LTB4等具有回调作用,提示其降糖作用机制可能与改善糖、脂及氨基酸等代谢紊乱有关,为寻找玉米须降糖作用靶点提供了科学依据。
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