癌症已经成为威胁人类健康的头号杀手。近年来，随着社会经济的不断发展，癌症的发病率和死亡率在我国呈不断上升趋势[1]。其中，乳腺癌已成为威胁女性健康的最大隐患，在我国，平均每45位女性中就有1位罹患乳腺癌[2-3]。因此，如何治疗乳腺癌仍然是医药工作者们的重点攻克对象。常规的药物治疗效果有限，而放射疗法或者外科手术对患者身体的伤害更甚。因此，在现有基础上，通过药物的不同作用机制，尝试药物的不同组合方法，从不同途径上遏制乳腺癌的发生发展，对于乳腺癌的治疗有着积极的推动意义。
通过大量的实验，本课题组发现一种化合物舒林酸。实验证明，舒林酸通过抑制类维甲酸受体的截断形式(以下简称tRXRα)与p85α之间的相互作用，能诱导肿瘤细胞凋亡，发挥抗癌作用。然而，因其抑制环氧化酶1 (cyclooxygenase-1, COX-1)和环氧化酶2 (cyclooxygenase-2, COX-2)的活性，舒林酸会引起如胃肠道出血及心脏毒性等副作用，这些缺点制约了该药物发展成为临床上真正的抗肿瘤药物。本课题组通过计算机辅助设计，以化学方法合成了一系列舒林酸衍生物，发现其中一个衍生物K-80003具有更强的tRXRα亲合性，对包括乳腺癌在内的多种肿瘤具有更好的抗癌效果，且不具有抑制COX-2活性的作用[4-5]。目前，K-80003是全球首个以tRXRα为靶点的原创候选新药，具有非常广阔的前景。
胞外信号调控激酶(extracellular signal-regulated kinase, ERK)是一类丝/苏氨酸蛋白激酶，处于RAS/RAF/MEK/ERK信号通路的最下游，正常定位于胞质，激活后转位至胞核，调节转录因子活性，产生细胞效应。ERK在肿瘤侵袭和转移过程中起中介和放大信号的作用，一般情况下，在肿瘤细胞中高表达[6]。但是在我们前期研究中发现，在乳腺癌细胞中，K-80003可以意外地激活p-ERK，所以我们设想，将K-80003与一种MEK抑制剂GDC-0973联合用药的话，一方面抑制了PI3K/Akt信号通路[4]，另一方面可以抑制由K-80003引起的ERK信号通路的激活，理论上可以对乳腺癌形成双重阻断，使抗肿瘤效果更为明显。
1 材料 1.1 细胞株人乳腺癌细胞株MCF-7 (ATCC)。
1.2 实验动物自发乳腺癌MMTV-PyMT转基因小鼠，SPF级，♀，8周龄，自主繁殖于厦门大学实验动物中心。
1.3 药物与试剂K-80003(康龙化成新药技术有限公司合成，纯度>98%)；GDC-0973(MCE公司，货号HY-13064)。β-actin抗体(Sigma公司，A5441)；p-ERK抗体(CST公司，4370S)；PARP(Santa Cruz公司，sc-7156)；免疫组化兔二抗(PV-9001)、DAB显色液(ZLI-9018)，均购于中杉金桥公司；DMEM(Hyclone公司)；胎牛血清(GEMINI公司)。
1.4 仪器Model 3550酶标仪、CO2细胞培养箱(Thermo公司)；Eps 200电泳仪(Tanon公司)；光学显微镜(Beckman公司)；组织包埋机、石蜡切片机(Leica公司)。
2 方法 2.1 细胞实验将MCF-7细胞以每孔3×105个细胞的密度接种于12孔板，细胞贴壁后，分为正常对照组、K-80003单药组(40 μmol·L-1)、GDC-0973单药组(5 μmol·L-1)、联合用药组(K-80003 40 μmol·L-1+GDC-0973 5 μmol·L-1)，并另设一组加入TNF-α(20 μg·L-1)模拟肿瘤细胞微环境。收样后提取相关蛋白，Western blot法检测各组中相关蛋白的表达差异，实验独立重复3次。
2.2 实验动物分组与给药挑选肿瘤均匀的8周龄左右MMTV-PyMT小鼠，按照体质量随机分为4组：正常对照组、K-80003单药组(30 mg·kg-1)、GDC-0973单药组(5 mg·kg-1)、联合用药组(K-80003 30 mg·kg-1+GDC-0973 5 mg·kg-1)，每组7只。分别于每日15 : 00灌胃给予不同药物。连续给药15 d，末次给药后3 h眼部取血，断脊处死后，常规解剖收样，进行后续分析。解剖时，对各组小鼠的体质量、肿瘤质量进行称重记录，同时计算肿瘤质量抑制率：肿瘤质量抑制率=(对照组肿瘤质量-实验组肿瘤质量)/对照组肿瘤质量×100%。
2.3 肿瘤组织切片染色实验取新鲜的肿瘤样品，放入4%多聚甲醛中固定过夜后，石蜡包埋。将组织蜡块在组织切片机上做连续4 μm切片，脱蜡后，HE染色进行形态学评价。另取一张相同组织的石蜡切片，脱蜡后，对相应蛋白进行免疫组化染色，通过光学显微镜观察染色结果，棕黄色为阳性信号。
2.4 统计学分析采用Prism Graphpad 6统计软件分析数据，数据以x±s表示，多组间比较采用ANOVA分析。
3 结果 3.1 联合用药能更好地促进肿瘤细胞凋亡如Fig 1所示，当给药时间为6 h时，联合用药组PARP出现明显切割带，且在TNF-α模拟肿瘤微环境的刺激下，此现象更加明显，说明联合用药组在MCF-7细胞中促进细胞凋亡的作用优于K-80003单药组。同样的，提取小鼠肿瘤组织蛋白，Western blot检测发现，联合用药组的PARP切割更为明显，说明联合用药组在抑制小鼠肿瘤方面效果更好。
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| Fig 1 K-80003 in combination with GDC-0973 promotes cancer cell apoptosis A: Western blot analysis of PARP in MCF-7 cell line, 0% FBS 6 h. K-80003: 40 μmol·L-1; GDC-0973: 5 μmol·L-1; TNF-α: 20 μg·L-1；B: Western blot analysis of PARP in tumor tissue. |
对小鼠体质量、肿瘤质量、肿瘤抑制率分析发现，联合用药组与K-80003单药组相比，抑制小鼠肿瘤生长作用更为明显(Fig 2)。小鼠肿瘤组织的石蜡切片染色结果显示，联合用药组肿瘤质地比较松散，提示肿瘤发展并未达到十分严重的阶段。同时，标志着肿瘤细胞生长的蛋白Ki-67表达也大幅度降低，说明联合用药组能够更好地抑制肿瘤生长。
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| Fig 2 K-80003 in combination with GDC-0973 inhibits growth of tumor in MMTV-PyMT mammary transgenic mice(x±s, n=7) A: Tumor weight; B: Tumor growth inhibition rate; C: HE staining and IHC analysis Ki-67 in tumor tissue. *P<0.05, **P<0.01 vs control; ##P<0.01 vs K-80003. |
如Fig 3所示，在MCF-7细胞和小鼠肿瘤组织中均可以检测到，由K-80003激活的p-ERK在联合用药组中完全被抑制。免疫组化染色结果进一步显示，K-80003激活的p-ERK在联合用药组中基本不表达。以上结果提示，联合用药通过抑制p-ERK的表达，从而提高K-80003治疗乳腺癌的敏感性，加强了治疗效果。
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| Fig 3 Effect of K-80003 in combination with GDC-0973 on p-ERK A: Western blot analysis of p-ERK in MCF-7 cells line. 0% FBS 1 h. K-80003: 40 μmol·L-1; GDC-0973: 5 μmol·L-1; TNF-α: 20 μg·L-1; B: Western blot analysis of p-ERK in tumor tissue; C: IHC analysis of p-ERK in tumor tissue. |
乳腺癌的治疗，仍然是摆在当今世界医学界的一道难题。常规的化疗手段对患者的精神和经济都造成了严重的负面影响，且预后较差，不能从根本上抑制乳腺癌的产生和发展[7-8]。因此，开发更多的药物靶点，从源头上抑制乳腺癌的产生和发展成为科研工作者的研究热点。找到特异性靶向肿瘤发生发展中关键基因的配体[9-10]，开发新药，可以有效减少患者由传统疗法带来的痛苦感，将肿瘤的发生和发展遏制在摇篮阶段。本课题组前期在对K-80003抗乳腺癌的研究中，意外发现给小鼠灌胃K-80003时，小鼠肿瘤细胞受到抑制的同时，肿瘤细胞内的p-ERK出现了异常激活现象，这与我们对ERK信号通路的常规认知相悖，由此我们对这个现象展开了积极讨论。那么基于以上的猜想，小鼠灌胃K-80003的同时，使用一种业界公认的ERK信号通路抑制剂，从两条途径上阻断乳腺癌的产生和发展，是否会达到更好的效果？本实验结果表明，高浓度、短时间K-80003刺激下，ERK作为一条应激生存通路会在细胞中反常激活，而联合用药时，GDC-0973可以抑制由K-80003引起的ERK激活，从而达到更好的治疗效果，在细胞上和动物上都有着较为稳定的结论。本实验还有一些比较有意思的现象值得讨论：已知K-80003是视黄醇X受体(retinoid X receptor, RXR)的配体，有研究表明，K-80003能够修饰RXR，修饰后的RXR可广泛作用于体内各种信号通路，如PI3K/Akt信号通路等[4]。细胞内信号通路往往联系紧密复杂，那么，在K-80003的刺激下，RXR能否与这些信号通路相互作用，从而对ERK信号通路产生影响？而且，大部分信号通路的激活是一个短暂的、瞬时的过程，在经过一定时间后，细胞内的信号通路变化可能与短时间的结果有所不同。K-80003长时间，甚至是低浓度的稳定刺激下，ERK信号通路还会有怎样的变化？对于这些问题的深入研究，可以帮助我们进一步揭示乳腺癌的发病机制，从而更好地对抗乳腺癌。
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