2. 重庆市抗肿瘤天然药物工程技术研究中心,重庆 404120;
3. 重庆三峡学院外国语学院英语系专业英语教研室,重庆 404120
2. Chongqing Engineering Research Center of Antineoplastic Natural Drugs, Chongqing 404120, China;
3. Dept of Medical English, School of Foreign Languages, Chongqing Three Gorges University, Chongqing 404120, China
溶栓治疗、冠状动脉介入和冠状动脉旁路移植术能使缺血的心肌恢复血液灌注,缩小心肌梗死面积,降低死亡率。然而,再灌注后出现的心律失常、心肌顿抑、无复流现象、心功能不全,也在威胁着患者的生命。因此,开发安全有效的抗心肌缺血/再灌注损伤(myocardial ischemia/reperfusion injury,MI/RI)药物,改善冠心病患者预后,仍是需要迫切解决的重要问题。
柚皮苷(naringin,Nar)是一种存在于葡萄柚、橘、橙的果皮和果肉中的二氢黄酮类化合物。有研究表明,柚皮苷通过抑制炎症、氧化应激和NF-κB在体内外的激活,减轻糖尿病视网膜病变[1]。柚皮苷通过调节一氧化氮水平,对大鼠内脏缺血/再灌注损伤产生保护作用[2]。富含柚皮苷的川芎皮对小鼠全脑缺血/再灌注损伤有保护作用[3]。柚皮苷抑制糖尿病心肌病氧化应激和内质网应激[4]。然而,柚皮苷在MI/RI中的心脏保护机制,尤其是与内质网应激(endoplasmic reticulum stress,ERS)相关的信号通路,尚不十分清楚。本研究拟建立H9c2心肌细胞缺氧/复氧(hypoxia/reoxygenation,H/R)损伤模型,通过MTT法检测细胞存活率,TUNEL染色检测细胞凋亡,Western blot检测CCAAT/增强子结合蛋白同源蛋白(CCAAT/enhancer-binding protein-homologous protein,CHOP)、活化转录因子4(activating transcription factor 4,ATF4)、真核翻译起始因子2α(eukaryotic translation initiation factor 2α,eIF2α)、p-eIF2α、双链RNA样内质网激酶(double-stranded RNA like endoplasmic reticulum kinase,PERK)、p-PERK蛋白表达变化,探讨Nar对H9c2心肌细胞H/R损伤中内质网应激凋亡途径的影响及其分子作用机制。
1 材料 1.1 细胞株与分组H9c2心肌细胞株,购自中国科学院上海生科院细胞资源中心。细胞培养达80%~90%融合后,将H9c2心肌细胞随机分为5组:正常对照组(C)、H/R组、Nar 10 mg·L-1组(L)、Nar 20 mg·L-1组(M)、Nar 40 mg·L-1组(H)。
1.2 药物与试剂Nar购自美国Sigma公司,批号:15015502,纯度≥95%。MTT试剂盒(Sigma公司,批号:146500700);DMEM培养基(批号:12800017)、胎牛血清(批号:10099133),均购自美国Gibco公司;胰蛋白酶(碧云天生物技术研究所,批号:C0201);TUNEL试剂盒(瑞士Roche公司,批号:REF 11684817910);PERK抗体(批号:ab79483)、p-eIF2α抗体(批号:ab32157)、ATF4抗体(批号:ab23760)、CHOP抗体(批号:ab11419),均购自Abcam公司;p-PERK抗体(Cell Signaling Technology公司,批号:3179S);eIF2α抗体(Santa Cruz公司,批号:133132);ECL增强化学发光检测试剂盒(Pierce公司,批号:34580)。
1.3 仪器CL31R型低温超速离心机、多功能酶标仪(美国Thermo公司);IX70倒置荧光显微镜(日本Olympus公司);GDS8000凝胶扫描系统(美国UVP公司)。
2 方法 2.1 H/R模型的建立参照文献[5],C组用含10%胎牛血清的DMEM培养基,在通有95%空气+5% CO2的37 ℃培养箱内正常培养24 h;H/R组将心肌细胞置换到无糖、无血清、缺氧的DMEM培养基中培养4 h,更换为正常培养基,然后恢复培养24 h;H/R加不同浓度Nar预处理组:分别加入柚皮苷10、20、40 mg·L-1,对心肌细胞预处理6 h,在氧气和葡萄糖剥夺下培养4 h,然后恢复培养24 h。
2.2 MTT法检测细胞存活率将H9c2细胞培养至密度为90%左右,进行细胞计数,按实验分组接种于96孔培养板中,每孔的细胞数为5×103个,每组设3个复孔,接种后置于37 ℃、5% CO2培养箱中分别培养24 h。分别在给药组中加入终浓度为10、20、40 mg·L-1的柚皮苷,培养6 h后,将H/R和柚皮苷3个剂量组在无糖、无血清、缺氧的DMEM培养基中处理4 h,之后在正常条件下培养24 h。C组不作任何处理。每个实验组分别处理后,加入5 g·L-1 MTT溶液10 μL,置于37 ℃培养箱中孵育4~6 h,小心吸去上清。每孔加入150 μL DMSO以溶解细胞形成的紫色结晶,在酶标仪上测定其在490 nm处OD值,进行数据分析。细胞存活率=实验组OD/对照组OD×100%,重复测定3次。
2.3 TUNEL染色检测细胞凋亡按TUNEL原位细胞凋亡检测试剂盒的说明书操作。细胞爬片经多聚甲醛固定及PBS洗涤后,TUNEL法原位标记心肌凋亡细胞核。光镜200倍下观察,凋亡细胞核染成棕黄色,正常细胞核染成蓝色。
2.4 Western blot检测复氧处理结束后,迅速收集各组细胞,用预冷的PBS小心洗涤3遍,加入含有PMSF的细胞裂解液,置于冰上作用30 min。12 000 r·min-1离心15 min,取上清液,用BCA法测定蛋白浓度并进行蛋白定量,经聚丙烯酰胺变性凝胶电泳分离蛋白,用湿转法将蛋白转移到聚偏氟乙烯膜,50 mol·L-1脱脂牛奶封闭,分别加入CHOP、ATF4、p-PERK、PERK、p-eIF2α、eIF2α抗体(1:2 000),4 ℃过夜,TBST洗3次,加对应1:5 000稀释的辣根过氧化物酶标记的二抗,室温孵育2 h,TBST洗3次,使用ECL-plus试剂盒发光,通过生化检测系统成像并分析结果,以β-actin作为内参照,检测目的蛋白表达情况。
2.5 统计学处理采用SPSS 13.0软件进行数据统计分析。所有数据用x±s表示,多组间数据比较用单因素方差分析(one-way ANOVA)。
3 结果 3.1 柚皮苷对H/R引起的心肌细胞存活率的影响Fig 1结果显示,与C组相比,H/R组中H9c2心肌细胞存活率明显降低(P<0.05);与H/R模型组相比,Nar预处理可以增加H/R损伤细胞的存活率,且Nar 40 mg·L-1组效果最好(P<0.05)。
3.2 柚皮苷对H/R引起的心肌细胞凋亡的影响Fig 2结果显示,与C组相比,H/R组心肌细胞TUNEL阳性核细胞比例明显增加(P<0.05);与H/R模型组相比,H/R+Nar组TUNEL阳性核细胞比率明显降低(P<0.05)。
3.3 柚皮苷对H9c2心肌细胞内质网应激分子表达的影响Fig 3的Western blot结果显示,与C组相比,H/R组CHOP、ATF4、p-eIF2α/eIF2α、p- PERK/PERK表达水平升高(P<0.05);与H/R组比较,柚皮苷3个剂量组可使CHOP、ATF4、p-eIF2α/eIF2α、p-PERK/PERK表达水平降低,以柚皮苷20、40 mg·L-1组效果明显(P<0.05)。
4 讨论柚皮苷具有抗氧化、抗凋亡、抗炎、抗癌等药理作用。有研究表明,柚皮苷通过抑制p38 MAPK通路,保护心肌细胞免受阿霉素诱导的凋亡。体内研究表明,柚皮苷通过促进细胞凋亡,抑制卵巢肿瘤增殖[6-7]。柚皮苷能保护心肌细胞,对抗阿霉素诱导的心肌细胞损伤,降低葡萄糖调节蛋白78(glucose regulated protein 78, GRP78)的表达及活性氧的产生,其保护作用可能与抗氧化应激及内质网应激有关[8]。H9c2心肌细胞被广泛认为是心肌系统研究的细胞模型,在体外研究H/R损伤细胞方面,已经建立了H/R诱导的H9c2细胞损伤模型[9]。因此,我们研究了柚皮苷在H/R中的作用及其可能的保护机制。本研究在H9c2心肌细胞H/R之前,用Nar预处理6 h,缺氧4 h复氧24 h后,采用MTT法检测细胞存活率,TUNEL法检测细胞凋亡。结果显示,H/R处理后,H9c2心肌细胞存活率降低,凋亡明显增加,而使用Nar后,可明显抑制H/R诱导的H9c2心肌细胞凋亡。这些结果与柚皮苷通过Nrf2信号通路,对H/R诱导的H9c2细胞凋亡的保护作用研究结果一致[9]。提示柚皮苷通过抑制细胞凋亡,保护H9c2心肌细胞免受H/R损伤。
MI/RI常见的机制有氧化应激、Ca2+超载、细胞凋亡与自噬等。内质网应激是细胞凋亡三大途径之一[10],内质网应激在缺血心肌细胞凋亡中起着重要作用。雷帕霉素[11]、黄芪甲苷[12]等通过抑制内质网应激,发挥心肌保护作用,提示抑制ER应激可能是一个主要的治疗靶点。为了证实柚皮苷的保护机制是否与内质网应激诱导的体外心肌细胞H/R损伤有关,本研究进一步探讨了内质网应激介导的心肌细胞凋亡在柚皮苷对H/R诱导的H9c2心肌细胞损伤中的作用。结果发现,柚皮苷可逆转H/R诱导的H9c2细胞内质网应激相关蛋白CHOP、ATF4、p-eIF2α/eIF2α、p-PERK/PERK的表达上调,抑制了内质网应激相关信号通路PERK-eIF2α-ATF4-CHOP的激活。
在MI/RI中, 心肌细胞通过CHOP和caspase-12信号通路的激活,而产生细胞凋亡[13]。CHOP可引起Bcl-2蛋白家族成员失衡,进而促进细胞色素C从线粒体释放,激活凋亡信号通路及相关的级联反应,最终心肌细胞在内质网应激诱导下的细胞凋亡增加[14]。根据上述结果以及柚皮苷对H/R细胞凋亡的抑制作用,我们认为,柚皮苷通过抑制内质网应激,减轻H/R诱导的细胞凋亡。表明柚皮苷改善了H/R诱导的细胞毒性和凋亡,与调节内质网应激相关信号通路有关。
综上所述,本研究结果表明,柚皮苷对H/R损伤的H9c2心肌细胞有保护作用,提示柚皮苷对H/R损伤的保护作用可能与激活PERK-eIF2α-ATF4-CHOP信号通路,进而抑制内质网应激及其介导的细胞凋亡有关。柚皮苷抑制内质网应激介导的细胞凋亡可能是一种新的心肌保护机制,可建立一种逆转MI/RI的治疗途径。然而,本研究仅限于MI/RI的体外细胞模型,还需进一步开展体内或临床研究来证明柚皮苷对MI/RI的心脏保护作用。
( 致谢: 感谢重庆三峡医药高等专科学校工程中心实验室为本课题研究提供仪器设备和技术支持。)
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