2. 广西医科大学药学院，广西 南宁 530021;
3. 广西医科大学第一附属医院结直肠肛门外科，广西 南宁 530021;
4. 广西生物医药协同创新中心，广西 南宁 530021
2. Dept of Pharmacy, Guangxi Medical University; Nanning 530021, China;
3. Dept of Colorectal Anal Surgery, the First Affiliated Hospital of Guangxi Medical University; Nanning 530021, China;
4. Guangxi Biomedical Collaborative Innovation Center; Nanning 530021, China
美国癌症协会最新统计结果显示，2018年美国将有173万癌症病例和60多万癌症死亡病例，其中将有26 240个新增胃癌病例和10 800个胃癌死亡病例[1]。因此，胃癌是一个世界性公共卫生问题，手术和化疗是胃癌的主要治疗手段[2]，在降低死亡率方面一直有效，但胃癌患者的5年生存率仍然相对较低[3]。因此，找到一种新的方法来治疗胃癌至关重要。当今各种新型的天然化合物，如足叶草毒素、紫杉醇、喜树碱和长春碱，已经被分离出来，并作为癌症治疗的有效药物，但其副作用较大[4]。迷迭香酸(rosmarinic acid，RA)是一种天然的苯酚羧酸，它是一种次生代谢物，通常被用作烹饪草药，常见于草本植物中，如迷迭香、鼠尾草、百里香和薄荷[5]。RA具有多种药理作用，包括抗癌、抗微生物、抗过敏、抗炎、抗氧化等[6]。基于RA的药理作用十分广泛，本课题组前期合成了十几种迷迭香酸类似物(rosmarinic acid analogue，RAA)[7]。通过筛选，我们发现迷迭香酸类似物-11(rosmarinic acid analogue-11，RAA-11)的细胞抗癌作用较为突出，其分子质量为377.34，化学结构式见Fig 1。本课题拟用RAA-11作用于人胃癌MGC-803细胞，了解其对细胞增殖及凋亡的影响，并探讨其可能机制，为进一步开发RAA提供理论依据。
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| Fig 1 Chemical structure of RAA-11 |
RAA-11由广西医科大学药学院李清老师合成鉴定，纯度≥98%(RAA-11溶于DMSO制成50 mmol·L-1储备液，-20 ℃避光保存，实验时用含血清RPMI 1640培养基稀释成高、中、低终浓度分别为40、20、10 μmol·L-1)。RPMI 1640培养基购自美国Gibco公司；Hoechst 33258染色液(即用型)购自北京索莱宝科技有限公司；南美胎牛血清购自依科赛生物科技(太仓)有限公司；Annexin V-FITC/PI细胞凋亡检测试剂盒购自美国BD公司；BCA蛋白浓度测定试剂盒(增强型)、SDS-PAGE凝胶配制试剂盒购自上海碧云天生物技术有限公司；ERK、p-ERK、GAPDH、Bax、Bcl-2、caspase-3兔抗人单克隆抗体，购自美国CST公司。
1.2 仪器全自动酶标仪(美国伯腾仪器有限公司)；BX53荧光显微镜(日本奥林巴斯股份有限公司)；流式细胞仪(美国BD公司)；电泳仪、半干转印槽(美国Bio-Rad公司)；LI-COR Odyssey红外荧光扫描成像系统(美国LI-COR公司)。
2 方法 2.1 细胞培养人胃癌细胞株MGC-803购自中国科学院上海细胞库(由广西医科大学第一附属医院胃肠外科肖强课题组赠予)，于含5% CO2的37 ℃恒温培养箱中，用含10%胎牛血清和1%青链霉素的RPMI 1640培养基常规培养，隔天更换培养基，长满后，用0.25%胰酶消化传代、冻存。
2.2 MTT法常规培养人胃癌MGC-803细胞，待处于对数生长期时进行消化，接种于96孔板，每孔100 μL，约5 000个/孔。贴壁后弃培养液，加入200 μL用RPMI 1640培养液稀释的终浓度分别为0、10、20、40、80、160 μmol·L-1的RAA-11，每个剂量组设5个复孔。分别培养24、36、48 h后，加入20 μL MTT，置37 ℃恒温箱孵育4 h后，每孔加100 μL DMSO剧烈震荡10 min，酶标仪上490 nm波长处测定各孔的吸光度值(OD)，细胞存活率=OD加药组/OD对照组×100%。
2.3 集落形成法取对数生长期的人胃癌MGC-803细胞进行消化，用完全培养基将细胞密度调整为1×106·L-1，充分吹打成单细胞悬液后置于6孔板中，每孔500 μL。贴壁后，每孔分别加入2 mL用RPMI 1640培养液稀释的终浓度为0、10、20、40 μmol·L-1的RAA-11，作用48 h后吸弃含药培养基，隔天更换完全培养基，让其生长2周(肉眼可见集落为准)，结束培养。PBS洗2次，室温晾干后，用多聚甲醛固定15 min。弃多聚甲醛晾干，0.1%结晶紫染色20 min后，在倒置显微镜下拍照，集落抑制率=(集落数对照组-集落数加药组)/集落数对照组×100%。
2.4 Hoechst 33258染色法取对数生长期的人胃癌MGC-803细胞进行消化，用完全培养基将细胞密度调整为2×107·L-1，接种到内嵌有无菌处理的盖玻片6孔板中，每孔2 mL。贴壁后，每孔分别加入2 mL用RPMI 1640培养液稀释的终浓度为0、10、20、40 μmol·L-1的RAA-11。作用48 h后，每孔加入1 mL 4%多聚甲醛，室温固定20 min，每孔用0.5 mL Hoechst 33258室温避光染色15 min，弃染色液，用PBS轻轻漂洗2遍。小心轻取盖玻片，放在干净载玻片上，加1滴抗荧光淬灭封片液(甘油：PBS=1：9)封片，于显微镜观察。
2.5 流式细胞术取对数生长期的人胃癌MGC-803细胞进行消化，用完全培养基将细胞密度调整为1.5×108·L-1，接种到6孔板，每孔2 mL。贴壁后，每孔分别加入2 mL用RPMI 1640培养液稀释的终浓度为0、10、20、40 μmol·L-1的RAA-11。作用48 h后收集细胞上清液，用胰酶消化贴壁细胞，将上清液和消化下的细胞1 000×g离心5 min。弃上清，加1 mL冰PBS重悬，1 000×g离心5 min，重复2次。弃PBS，加200 μL 1×Binding Buffer重悬后，加入5 μL PI和5 μL Annexin V，室温避光孵育15 min，再加入300 μL 1×Binding Buffer，300目滤网过滤1次，于1 h内上机。
2.6 Western blot取对数生长期的人胃癌MGC-803细胞进行消化，接种于25 cm2培养瓶中，待其长到80%~90%左右，每瓶分别加入3 mL用RPMI 1640培养液稀释的终浓度为0、10、20、40 μmol·L-1的RAA-11。作用48 h后，收集细胞上清液并消化细胞，PBS缓冲液洗3次后，加裂解液(RIPA：PMSF：Cocktail=100：1：1)冰上裂解20 min，4 ℃、12 000 r·min-1离心20 min。BCA法检测蛋白浓度后，上清液加上样蛋白缓冲液煮沸变性5 min。取40 μg蛋白样品先60 V恒压电泳，待样品电泳至分离胶后，将电压换成120 V电泳至胶底部。半干转印槽将蛋白转移至PVDF膜上，TBST洗膜3次，用5% BSA室温封闭30 min，一抗冰上孵育过夜。二抗室温避光孵育1 h，TBST避光洗膜3次后，用Odyssey红外荧光扫描成像系统扫描显影。
2.7 数据分析采用SPSS 20.0统计软件进行分析，数据用x±s表示，组间均数比较采用t检验，两组以上均数比较采用单因素方差分析。所有实验均重复3次。
3 结果 3.1 RAA-11对细胞增殖的抑制作用Tab 1结果显示，RAA-11对MGC-803细胞的增殖有明显抑制作用，并存在浓度依赖性和时间依赖性。线性回归结果得出RAA-11作用MGC-803细胞24、36、48 h的IC50分别是72.781、59.979、40.625 μmol·L-1。RAA-11作用MGC-803细胞48 h后，其浓度变化对细胞增殖的抑制作用较为突出，故选择RAA-11作用MGC-803细胞48 h进行后续实验。
| Concentration/ μmol·L-1 |
Cell survival rate/% | ||
| 24 h | 36 h | 48 h | |
| 0 | 100.000±0.000 | 100.000±0.000 | 100.000±0.000 |
| 10 | 91.341±3.055** | 90.239±1.509** | 75.596±1.671** |
| 20 | 80.016±1.732** | 71.608±1.399** | 61.442±1.553** |
| 40 | 65.559±1.522** | 53.342±1.434** | 47.293±1.497** |
| 80 | 48.634±2.082** | 42.399±2.066** | 16.116±1.103** |
| 160 | 24.011±3.002** | 16.752±2.551** | 12.403±1.094** |
| **P < 0.01 vs 0 μmol·L-1 group | |||
如Fig 2所示，与对照组比较，不同浓度RAA-11作用胃癌MGC-803细胞48 h后，MGC-803细胞的克隆抑制率随着药物浓度升高而升高，RAA-11浓度0、10、20、40 μmol·L-1的克隆抑制率分别为15.8%、62.8%、81.4%、88.6%。抑制效果具浓度依赖性，与MTT法共同说明RAA-11可以有效抑制胃癌MGC-803细胞的增殖。
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| Fig 2 Influence of different concentrations of RAA-11 on colony inhibition rate of human gastric cancer MGC-803 cells (x±s, n=3) **P < 0.01 vs 0 μmol·L-1 group |
如Fig 3所示，与对照组比较，RAA-11作用MGC-803细胞48 h后，细胞出现明显的凋亡特征，在荧光显微镜下呈强荧光反应，随着药物浓度增加，细胞凋亡率明显上升。结果提示RAA-11对MGC-803细胞有一定的促凋亡作用。
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| Fig 3 Influence of different concentrations of RAA-11 on nucleus apoptotic morphology and apoptotic rate of human gastric cancer MGC-803 cells (×200) A:RAA-11 0 μmol·L-1; B: RAA-11 10 μmol·L-1; C:RAA-11 20 μmol·L-1; D:RAA-11 40 μmol·L-1; E:Histogram of apoptosis rate(x±s, n=3). The arrows pointed to the apoptotic nucleus.**P < 0.01 vs 0 μmol·L-1 group. |
如Fig 4所示，RAA-11(0、10、20、40 μmol·L-1)作用于MGC-803细胞48 h后，细胞凋亡率明显升高。结果表明，RAA-11能够引起MGC-803细胞的凋亡，且呈剂量依赖关系。
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| Fig 4 Influence of different concentrations of RAA-11 on apoptotic rate of human gastric cancer MGC-803 cells (x±s, n=3) A:RAA-11 0 μmol·L-1; B: RAA-11 10 μmol·L-1; C:RAA-11 20 μmol·L-1; D:RAA-11 40 μmol·L-1; E:Histogram of cell apoptosis rate.**P < 0.01 vs 0 μmol·L-1 group. |
Fig 5的Western blot结果显示，RAA-11作用于MGC-803细胞48 h后，与对照组比较，抑凋亡蛋白Bcl-2表达降低，促凋亡蛋白Bax和caspase-3表达增加，提示RAA-11可诱导MGC-803细胞的凋亡。
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| Fig 5 Influence of different concentrations of RAA-11 on apoptosis related protein expressions in human gastric cancer MGC-803 cells (x±s, n=3) **P < 0.01 vs 0 μmol·L-1 group |
如Fig 6所示，RAA-11作用于MGC-803细胞48 h后，与对照组比较，通路蛋白ERK、p-ERK表达明显下调，提示RAA-11可能通过抑制MAPK-ERK通路来诱导MGC-803细胞凋亡。
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| Fig 6 Influence of different concentrations of RAA-11 on ERK pathway protein expressions in human gastric cancer MGC-803 cells (x±s, n=3) **P < 0.01 vs 0 μmol·L-1 group |
RA是一种含多酚羟基的化合物，化学名称为R(t)2-[[3-(3，4-二羟基苯基)-1-氧代-2-丙烯基]氧基]-3，4-二羟基苯丙酸，由一分子咖啡酸和一分子3，4-二羟基苯基乳酸缩合而成[8]，其成分主要为二萜酚类、黄酮类、三萜类、精油等。RA具有较好的水溶性和稳定性，且具有抗氧化、抗菌、美容、抗肿瘤、消炎、抗心血管疾病等诸多作用[9]，近年来，其抗肿瘤效果颇受关注。RA植物来源丰富，可通过多种途径发挥抗肿瘤作用[10]，作为抗肿瘤药物具有良好的应用前景。
细胞凋亡是最常见的细胞生理性死亡形式(即非病理性细胞死亡)，可发生于胚胎发育、组织重建、免疫调节及肿瘤退化的各个时期[11]。caspase-3是一种含有277个氨基酸残基的蛋白酶，分子质量约32 ku，是caspase家族在细胞凋亡过程中最主要的终末剪切酶之一。其下游因子Bcl-2是一种癌基因，它具有抑制凋亡的作用，目前已经发现的Bcl-2蛋白家族按功能可分为两类：一类是像Bcl-2一样具有抑制凋亡作用，如Bcl-xL、Bcl-w、Mcl-1、A1等; 而另一类具有促进凋亡作用，如Bax、Bcl-xS、Bik/Nbk、Bid等[12]。我们的研究显示，RAA-11能够促进凋亡启动因子caspase-3和促凋亡因子Bax的表达，抑制抑凋亡因子Bcl-2的表达，提示RAA-11能够诱导人胃癌MGC-803细胞的凋亡。
ERK是一类丝/苏氨酸蛋白激酶，是传递丝裂原信号的信号转导蛋白[13]。它正常定位于胞质，当激活后转位至胞核，调节转录因子活性，产生细胞效应。已知ERK家族有5个亚族，包括ERK1~ERK5，其中ERK1和ERK2途径是ERK家族中研究最彻底的[14]。ERK调节着细胞的增殖、分化和存活，是多种生长因子(EGF、NGF、PDGF等)的下游蛋白。ERK及其信号途径在肿瘤侵袭和转移过程中起中介和放大信号的作用：一方面，接受大量来自生长因子、丝裂原、环境刺激等的信号；另一方面，通过ERK信号级联反应作用于核转录因子，如AP-1、NF-κB等，调控基因表达。在许多人类的癌症(如口腔癌、黑色素瘤、乳腺癌等)中都可发现ERK的过度激活[15]。本研究显示，RAA-11明显下调了通路蛋白ERK、p-ERK的表达量，我们猜想RAA-11可能通过抑制ERK/MAPK通路，抑制人胃癌MGC-803细胞增殖并诱导其凋亡。
综上所述，本研究显示，RAA-11能够有效抑制人胃癌MGC-803细胞的增殖，并诱导其凋亡。然而，RAA-11这些效应的确切机制仍不清楚。我们的初步研究结果表明，RAA-11诱导MGC-803细胞凋亡可能与其抑制ERK/MAPK通路有关，为RAA-11的开发与应用奠定了科学的理论基础。
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