2. 广州医科大学附属第二医院药学部，广东 广州 510260;
3. 中山大学附属第一医院药学部，广东 广州 510080
2. Dept of Pharmacy, the Second Affiliated Hospital of Guangzhou Medical University, Guangzhou 510260, China;
3. Dept of Pharmacy, the First Affiliated Hospital of Sun Yat-sen University, Guangzhou 510080, China
核因子κB(nuclear factor kappa B，NF-κB)是一种多效转录因子。正常细胞中的NF-κB处于失活状态，它主要以p50/p65二聚体形式与其抑制蛋白(inhibitor kappa B，I-κB)结合，存在于胞质中。活性氧、细胞因子等多种刺激可诱导I-κB磷酸化，使其与p50/p65解离而活化NF-κB，并转移至胞核内，与凋亡相关基因结合促进基因转录，诱导细胞凋亡，造成机体损害。氧化应激是多种疾病炎性病变的重要因素，而NF-κB-诱导型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase，iNOS)-NO信号通路是机体内一条重要的氧化应激通路[1-3]，NF-κB的活化不仅使许多编码炎症介质、细胞因子等的促炎症基因表达上调，而且可以激活iNOS等相关酶类及血管细胞黏附分子，使炎症反应级联放大，激活炎症介质趋化及相关炎症细胞。
知母为百合科植物知母(Anemarrhena asphodeloides Bge)的干燥根茎，味苦，性寒，归肺、胃、肾经，具有清热泻火、滋阴润燥等功效，主治温热病、高热烦渴、咳嗽气喘、燥咳、便秘、骨蒸潮热、虚烦不眠、消渴淋浊等症，是一种常用的苦寒清热传统中药，其主要的活性成分为知母皂苷(saponins from Anemarrhena asphodeloides Bge，SAaB)。研究表明，SAaB具有抗肿瘤、抗凝血、抗阿尔茨海默病、改善学习记忆、抗血栓、降脂、降糖等作用[4-5]。最新研究发现，SAaB还可明显抑制肥大细胞TNF-α、IL-6合成与释放[6]，以及抑制小鼠嗜碱性粒细胞释放各种炎症介质[7]。课题组前期研究发现，SAaB能够明显下调糖尿病大鼠血浆中TNF-α、IL-6含量[8]，推测其多种药理作用可能与抗炎活性密切相关，但具体的抗炎机制尚不清楚，可能与Toll样受体4(Toll-like receptor 4，TLR-4)/NF-κB、丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)-细胞外信号调节激酶(extracellular regulated protein kinases，ERK)、JAK-STAT等信号通路有关。目前，SAaB对RAW264.7细胞功能的影响尚未见报道。本研究以脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)诱导RAW264.7作为炎症细胞模型，探讨SAaB通过调节NF-κB-iNOS-NO信号通路对RAW264.7细胞功能的影响，进一步从细胞水平阐明其可能的抗炎机制，以期为其后续开发奠定理论基础。
1 材料 1.1 细胞RAW264.7细胞株，购自上海赛齐生物工程有限公司。
1.2 药物与试剂SAaB提取物按实验室前期提取纯化工艺制备(皂苷含量以菝葜皂苷元计52%)[9]，精确称取32 mg SAaB，用PBS溶解，配成320 mg·L-1的母液，-20 ℃储存备用。DMEM高糖培养基(批号p002548，Gibco)；IL-6 ELISA检测试剂盒(批号020680114)、TNF-α高灵敏度ELISA检测试剂盒(批号0282H80121)，均购自杭州联科生物技术股份有限公司；iNOS ELISA检测试剂盒(批号CK-E20450M，艾莱萨生物科技上海有限公司)；MTT(批号A1720090，Aladdin)；RIPA细胞裂解液、BCA蛋白定量试剂盒(北京普利莱基因技术有限公司)；化学发光剂ECL(碧云天生物技术研究所)；NF-κB p65抗体(美国Cell Signaling公司)；β-actin抗体(批号306010，美国Santa Cruz公司)；PE标记山羊抗小鼠、FITC标记山羊抗兔二抗(美国Santa Cruz公司)。
1.3 仪器倒置显微镜(江南显微镜有限公司)；酶标仪(美国Bio-Rad)；超净工作台(江苏净化设备有限公司)；二氧化碳培养箱(SL SHELLAB)；超低温冰箱(SANYO)；高速冷冻离心机(科大创新股份有限公司中佳分公司)。
2 方法 2.1 细胞培养RAW264.7细胞以完全培养基于37 ℃、5% CO2培养箱培养，当细胞融合度达到80%，吸弃培养基，PBS洗细胞2~3次后，加入胰酶，充分接触消化细胞，吹打收集细胞，1：3传代培养，隔天换液。
2.2 MTT法检测细胞增殖取对数生长期的细胞，消化后计数，调整细胞密度为3×109·L-1，接种于96孔板，培养24 h后，分别设置调零组、空白对照组、SAaB组(160、80、40、20、10、5、2.5、1.75 mg·L-1)，每组设置6个复孔，空白组和药物组每孔加入细胞液100 μL，调零组加入完全培养基100 μL，接种至96孔板中，CO2培养箱中培养24 h，吸弃上清，每孔加入100 μL MTT试剂，放入细胞培养箱中培养4 h，吸弃上清，每孔加入150 μL DMSO，置摇床10 min，酶标仪570 nm波长测量每孔的吸光度值。细胞存活率=(ODSAaB干预组-OD调零组)/(OD空白对照组-OD调零组)×100%。
2.3 细胞培养及分组取对数生长期的细胞，消化后计数，调整细胞密度为3×108·L-1，接种96孔板，预培养24 h后，分别设置：①空白对照组：正常培养的RAW264.7细胞组；②炎症模型组(LPS浓度为10 mg·L-1)；③LPS+SAaB组(SAaB浓度分别为30、3、0.3 mg·L-1)；④LPS+布洛芬组(100 mg·L-1)。每组设置6个复孔。空白组和炎症模型组每孔加入100 μL完全培养基，其余组加入相应含药物的完全培养基，继续培养箱培育1 h。
2.4 Griess法测定RAW264.7细胞中NO含量同“2.3”项下培养细胞并分组，除空白组外，每孔加入100 μL LPS(10 mg·L-1)，继续放入培养箱培养24 h后，每孔吸取50 μL细胞上清液至另一新的96孔板中，每孔加入50 μL A液(称取1.0 g无水对氨基苯磺酸于烧杯中，加入6 mL 85%浓磷酸，去离子水溶解定容至100 mL)，细胞培养箱孵育10 min后，每孔加入50 μL B液(取0.1 g N-1-萘乙二胺盐酸盐于烧杯中，去离子水溶解定容至100 mL)，摇床震荡10 min。酶标仪于546 nm处测量每孔的吸光度，后根据NaNO2标准溶液(精确称取6.9 mg NaNO2于烧杯中，去离子水溶解定容至10 mL)吸光度绘制标准曲线，算出每孔的NO浓度。
2.5 ELISA法测定RAW264.7细胞中TNF-α、IL-6、iNOS的含量同“2.3”项下培养细胞并分组，除空白组外，每孔加入100 μL LPS(10 mg·L-1)，继续培养24 h后，吸取细胞液上清，按ELISA试剂盒说明书，测定各组细胞TNF-α、IL-6、iNOS的含量。
2.6 Western blot法检测RAW264.7细胞中NF-кB p65蛋白表达同“2.3”项下培养细胞并分组，除空白组外，每孔加入100 μL LPS(10 mg·L-1)，继续培养24 h后，提取细胞总蛋白，采用BCA蛋白定量法检测各组细胞蛋白浓度，95 ℃灭活蛋白5 min，SDS-PAGE凝胶电泳，转膜，8%脱脂奶粉封闭1 h，一抗4 ℃孵育过夜，二抗室温孵育1 h，ECL显色。
2.7 统计学方法实验数据以x±s表示，采用SPSS 19.0统计软件及单因素方差分析(one-way ANOVA)处理数据。
3 结果 3.1 RAW264.7细胞形态特征各组RAW264.7细胞形态如Fig 1所示，正常RAW264.7细胞呈圆形或椭圆形，LPS刺激诱导24 h，模型组细胞形态改变明显，体积增大，拉伸呈梭形。与模型组比较，不同浓度SAaB与LPS共刺激，发现大部分细胞仍为圆形，形态趋向正常细胞。
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| Fig 1 Effects of SAaB on morphology of RAW264. 7 cells (×200) A: Control group; B: LPS group; C: LPS+Ibuprofen group; D: SAaB (0.3 mg·L-1) +LPS; E: SAaB (3 mg·L-1) +LPS; F: SAaB (30 mg·L-1) +LPS. |
Fig 2的MTT结果显示，SAaB在0~80 mg·L-1对正常RAW264.7细胞无毒性作用，但当浓度达到160 mg·L-1时，细胞活力下降。
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| Fig 2 Effects of SAaB on proliferation of RAW264.7 cells |
Griess法测定不同浓度SAaB干预下，LPS诱导的RAW264.7炎症细胞中NO含量。如Fig 3所示，与对照组相比，LPS诱导的RAW264.7细胞中NO含量明显增加(P＜0.01)；与LPS炎症模型组比较，SAaB各组中NO含量均明显下降(P＜0.01，P＜0.05)，且呈现浓度依赖性。
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| Fig 3 Effects of SAaB on contents of NO in RAW264.7 cells (x±s, n=6) ##P < 0.01 vs control group; *P < 0.05, **P < 0.01 vs LPS group |
Tab 1的ELISA检测结果显示，与对照组相比，LPS诱导的RAW264.7细胞中TNF-α、IL-6和iNOS表达量明显增加(P＜0.01)；与LPS炎症模型组比较，不同浓度SAaB干预组中TNF-α、IL-6和iNOS表达量明显下降(P＜0.01)。
| Group | Concentration/ mg·L-1 |
TNF-α/ μg·L-1 |
IL-6/ μg·L-1 |
iNOS/ μg·L-1 |
| Control | - | 0.83±0.15 | 0.96±0.03 | 5.53±0.54 |
| LPS | 10.00 | 4.80±0.07## | 2.74±0.04## | 15.27±0.97## |
| Ibuprofen | 100.00 | 3.01±0.02** | 1.79±0.07** | 10.17±0.50** |
| SAaB | 30.00 | 2.70±0.04** | 1.98±0.05** | 7.20±0.21** |
| 3.00 | 2.90±0.05** | 2.12±0.04** | 10.09±0.57** | |
| 0.30 | 3.01±0.01** | 2.23±0.03** | 10.61±0.31** | |
| ##P < 0.01 vs control group; **P < 0.01 vs LPS group | ||||
Fig 4的Western blot结果显示，LPS诱导的RAW264.7细胞中NF-κB p65蛋白的表达水平明显增加(P＜0.01)，而不同浓度SAaB干预组的表达量则明显下降。结果提示，SAaB能够抑制NF-κB p65蛋白的表达，抑制其转移至细胞核内，进而抑制炎症因子进一步活化。
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| Fig 4 Effects of SAaB on expression levels of NF-κB p65 protein in RAW264.7 cells (x±s, n=6) ##P < 0.01 vs control group; *P < 0.05, **P < 0.01 vs LPS group |
炎症反应是机体受到来自于内部或外部的刺激而产生的防御反应，在一定程度内起到保护机体的作用，但长期、剧烈的炎症反应会参与多种疾病的病理进程，如2型糖尿病、动脉粥样硬化、肿瘤、风湿性关节炎、慢性阻塞性肺疾病、感染性休克等[10-11]。炎症是这些疾病的病理基础，治疗免疫炎症反应，逐渐成为新药开发的重要靶点。
近年来研究表明，SAaB作为知母主要药理活性成分，具有明显的抗炎活性，临床应用前景广阔。然而，SAaB抗炎作用，尤其是对RAW264.7炎症细胞功能的调节机制研究并不深入。因此，本研究以RAW264.7细胞作为载体，采用LPS建立体外细胞炎症模型，探讨SAaB对LPS诱导的RAW264.7细胞功能的调控作用。
本研究结果显示，不同浓度的SAaB与LPS共刺激24 h后，仅160 mg·L-1的SAaB抑制RAW264.7细胞增殖，而浓度在0~80 mg·L-1的SAaB对正常RAW264.7细胞生长无明显抑制。这与160 mg·L-1的SAaB对RAW264.7细胞有细胞毒作用相关，说明实验设置的SAaB高、中、低剂量组(30、3、0.3 mg·L-1)无明显细胞毒性，具有研究意义。显微镜下观察到LPS刺激RAW264.7细胞24 h可以改变其形态，细胞体积增大，呈梭形，而0.3~30 mg·L-1的SAaB和LPS共同作用24 h后，细胞形态变规则，并恢复成圆形。
LPS诱导激活RAW264.7细胞，使iNOS水平明显增加，iNOS活化后会直接催化NO持续生成，导致NO释放量明显升高，进而使得细胞分泌释放重要的炎症标志因子TNF-α，而TNF-α在炎症网络中具有关键作用，是全身炎性反应的始动介质，可诱导IL-1和IL-6表达释放，使炎性损伤的级联效应放大，从而进一步加剧炎症反应[12-14]。NF-κB核转录因子作为炎症过程中起重要作用的转录因子，当细胞受到LPS刺激后，NF-κB活化二聚体会在NF-κB信号通路激活，易位进入细胞核内，并与细胞核内的靶基因在κB位点发生特异性结合，从而调控NO的生成和细胞因子TNF-α、IL-6等的表达和释放[15]。
本研究发现，SAaB可抑制LPS诱导的炎症细胞NO释放增加，并呈浓度依赖性，提示SAaB具有抗炎活性，且不是通过抑制细胞活力来抑制NO分泌。SAaB可下调NF-κB p65蛋白表达水平，同时减少TNF-α、IL-6等炎症因子的产生。此外，实验结果也提示了LPS可引起NF-κB p65的蛋白表达水平增高，并且在LPS诱导的炎症过程中，NF-κB-iNOS-NO三者的激活及产物的生成在时间上具有同步性，而使用阳性对照药(布洛芬)和SAaB后，均可抑制上述效应，进一步揭示了SAaB可通过NF-κB-iNOS-NO信号通路，抑制LPS诱导的炎症反应。以NF-κB-iNOS-NO信号通路为切入点，研究具有下调巨噬细胞该通路活性，并且能产生明显抗炎、抗免疫作用的药物，对于慢性免疫炎症性疾病的治疗具有广阔的应用前景。
综上所述，本研究结果表明SAaB可明显抑制LPS诱导的RAW264.7细胞中炎症因子NO、TNF-α、IL-6、iNOS的释放，并且能下调RAW264.7细胞NF-κB p65蛋白表达水平，表明SAaB能通过下调NF-κB-iNOS-NO信号通路，抑制炎症因子的过度表达，从而抑制炎症反应。本文从细胞水平初步探讨了SAaB抗炎的作用机制，为其临床应用与后续开发奠定了理论基础。
( 致谢: 本实验完成于广东药科大学中心实验室，感谢广州医科大学附属第二医院药学部的老师对本课题的指导，感谢课题组全体老师和同学对实验的支持与帮助。)
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