2. 安徽医科大学 第一附属医院肾内科, 安徽 合肥 230022;
3. 安徽医科大学 药学院, 安徽 合肥 230022;
4. 安徽医科大学 公共卫生学院流行病与卫生统计学系, 安徽 合肥 230022
2. Dept of Nephrology, the First Affiliated Hospital of Anhui Medical University, Hefei 230022, China;
3. School of Pharmacy, Anhui Medical University, Hefei 230032, China;
4. Dept of Epidemiology and Statistics, School of Public Health, Anhui Medical University, Hefei 230032, China
肝纤维化(hepatic fibrosis, HF)是肝脏对慢性肝损伤因素(如酒精性肝炎、非酒精性脂肪性肝炎、病毒性肝炎等)创伤修复应答的结果, 以胞外基质合成与分解平衡紊乱为特征。肝星状细胞(hepatic stellate cells, HSCs)在HF进展中起到重要作用。当肝脏受到急性或慢性损伤时, 静止的HSC变成活化状态, 转变为成纤维细胞, 活化的HSC是细胞外基质的主要来源[1]。
自噬是在胞内将受损的细胞器降解, 为细胞生存提供可重复利用物质和能量的过程, 在维持胞内稳态中起到重要作用。有研究报道[2], 在HSC活化过程中, 自噬潮增加, 通过自噬抑制因子干预自噬可抑制HSC的活化。奥曲肽(octreotide, OCT)是一种生长抑素类似物, 前期研究表明, OCT可缓解大鼠HF程度[3], 但OCT是否通过调节自噬发挥抗纤维化作用仍未明了。因此, 本研究建立CCl4肝纤维化模型, 探讨自噬在HF中的作用以及OCT对其的影响。
1 材料 1.1 实验动物清洁级♂SD大鼠30只, 体质量200~250 g, 购于安徽医科大学实验动物中心, 常温下自由饮水, 普通饲料喂养。
1.2 试剂用橄榄油将CCl4配成40%混合溶液; OCT(0.1 mg·mL-1)购于瑞士诺华公司; ECL发光试剂购于美国Thermo Fisher公司; 抗Collagen I和α-SMA单克隆抗体, 购于Proteintech公司; 抗LC3和Beclin-1单抗购于Abcam公司; 抗β-actin单抗、二抗, 购于北京中杉金桥生物技术公司。
2 方法 2.1 动物分组及造模大鼠随机分为对照组、模型组和OCT组, 每组10只。除对照组外, 均采用皮下注射40% CCl4(3 mL·kg-1), 每周2次。OCT组采用皮下注射OCT 10 μg·kg-1, 每日2次。同时对照组和OCT组均皮下注射等体积生理盐水。造模8周后处死大鼠, 收集待测标本。
2.2 血清学检测全自动生化分析仪(安徽医科大学第一附属医院检验科)检测丙氨酸氨基转移酶(ALT)、天冬氨酸氨基转移酶(AST)、总胆红素(TBIL)和白蛋白(ALB)的含量。
2.3 HE和Masson染色观察肝组织病理学变化取肝组织置于10%甲醛溶液中固定, 脱水, 包埋后切片, 行HE和Masson染色, 拍照并分析。
2.4 Western blot法检测大鼠肝组织Collagen Ⅰ、α-SMA、LC3和Beclin-1蛋白表达提取蛋白, 并用BCA法测定蛋白浓度。蛋白样品经SDS-PAGE电泳、转膜、封闭, 一抗4 ℃孵育过夜。次日TBST洗膜3次后, 置于相应二抗中, 常温孵育1 h。ECL发光试剂盒显影, 并用ImageJ软件分析条带灰度值。
2.5 统计学处理数据以x±s表示, 采用SPSS 16.0软件进行数据分析。计量资料组间两两比较采用LSD- t检验, 多组间比较采用单因素方差分析。
3 结果 3.1 大鼠血清学指标变化Tab 1结果显示, 与对照组相比, 模型组中大鼠ALT、AST和TBIL水平上升, ALB水平明显下降, 差异有统计学意义(P < 0.01);与模型组相比, OCT组ALT、AST和TBIL均降低, ALB水平增加, 差异有统计学意义(P < 0.05)。
| Group | ALT/U·L-1 | AST/U·L-1 | TBIL/μmol·L-1 | ALB/g·L-1 |
| Control | 59.60±14.03 | 120.40±23.08 | 5.42±0.848 | 37.31±0.89 |
| Model | 388.70±56.91** | 360.00±28.10** | 31.42±3.96** | 26.04±1.07** |
| OCT | 310.90±64.05## | 306.30±43.20## | 26.79±2.95# | 27.22±0.87# |
| **P < 0.01 vs control; #P < 0.05, ##P < 0.01 vs model | ||||
HE染色显示, 对照组肝小叶结构完整, 肝细胞大小、形态正常, 呈以中央静脉为中心的辐射状, 肝索排列整齐, 无胶原纤维增生; 模型组出现大量脂肪变性, 肝实质、肝小叶和肝索结构被破坏, 汇管区及周边组织有大量胶原结缔组织增生; OCT组肝脂肪变性, 结缔组织增生程度减轻。Masson染色显示, 对照组仅见汇管区有少量蓝色胶原纤维, 未见纤维增生; 模型组见汇管区及周围有大量蓝色胶原纤维增生, 肝小叶结构被破坏形成假小叶; OCT组见增生的胶原纤维明显减少, 假小叶数量减少。
3.3 大鼠肝组织Collagen Ⅰ、α-SMA、LC3和Beclin-1蛋白表达变化Tab 2的Western blot半定量结果显示, Collagen Ⅰ、α-SMA、LC3和Beclin-1蛋白在模型组中的表达水平较对照组升高(P < 0.05);相比于模型组, OCT组中Collagen Ⅰ、α-SMA、LC3和Beclin-1蛋白表达水平下降(P < 0.05)。
| Group | Collagen Ⅰ | α-SMA | LC3 | Beclin-1 |
| Control | 0.949±0.203 | 0.968±0.114 | 0.931±0.145 | 0.970±0.073 |
| Model | 1.558±0.071** | 1.711±0.066** | 1.893±0.275** | 1.690±0.104** |
| OCT | 1.299±0.133# | 1.396±0.114# | 1.304±0.780# | 1.340±0.055## |
| **P < 0.01 vs control; #P < 0.05, ##P < 0.01 vs model | ||||
自噬在HF的发生中起两面性作用。一方面, 自噬具有促肝纤维化作用。当HSC发生自噬时, 消化胞内脂滴为HSC活化提供能量, 诱导Ⅰ型胶原合成, 加速HF进程[4]。另一方面, 自噬又具有抗肝纤维化作用。通过去除过度沉积的脂滴、异常折叠的蛋白和受损的线粒体, 减少氧化应激和脂质过氧化的损伤, 从而维持受损肝细胞胞内的能量平衡。自噬又可促使单核细胞分化为巨噬细胞, 巨噬细胞自噬能够防止过多的炎症介质释放, 而抑制巨噬细胞自噬可促使炎症介质的分泌, 炎症介质又可促进单核细胞和中性粒细胞在肝组织中集聚, 诱导肝细胞凋亡, 从而通过抗炎作用发挥抗纤维化作用[5]。
有研究表明[6], OCT可通过抑制自噬减轻肾损伤的发生, 为此我们建立CCl4肝纤维化大鼠模型, 并用OCT干预。结果表明, 模型组大鼠肝功能异常, HE和Masson染色均显示肝组织有不同程度纤维化, 说明HF模型成功建立。模型组中大鼠肝组织LC3和Beclin-1含量高于对照组, 表明在CCl4诱导的HF大鼠肝组织中, 自噬标志性蛋白LC3和Beclin-1的表达水平上升, 证明自噬促进HF的发生。在OCT组中, 大鼠HF程度相比于模型组明显减轻, Collagen Ⅰ、α-SMA、LC3和Beclin-1蛋白含量均下降, 表明OCT抑制HF可能与其通过下调自噬标志性蛋白LC3和Beclin-1的表达, 进而抑制自噬的发生, 减少HSC的活化有关。
综上, OCT可通过减轻肝脏病理损伤, 下调Collagen I和α-SMA的表达而抑制HF, 同时下调LC3和Beclin-1的表达而抑制过度自噬, 缓解HF。我们将会在体外实验中进一步探索自噬及其相关蛋白在HF进展中的变化及作用。
| [1] |
Thoen L F, Guimarães E L, Grunsven L A. Autophagy:a new player in hepatic stellate cell activation[J]. Autophagy, 2012, 8(1): 126-8. doi:10.4161/auto.8.1.18105 |
| [2] |
Thoen L F, Guimarães E L, Dollé L, et al. A role for autophagy during hepatic stellate cell activation[J]. J Hepatol, 2011, 55(6): 1353-60. doi:10.1016/j.jhep.2011.07.010 |
| [3] |
张慧平, 张超, 李方跃, 等. 奥曲肽通过抑制内质网应激减轻肝纤维化大鼠肝损伤[J]. 实用医学杂志, 2017, 33(13): 2113-6. Zhang H P, Zhang C, Li F Y, et al. Octreotide attenuates liver injury in rats with hepatic fibrosis by inhibiting endoplasmic reticulum stress[J]. J Pract Med, 2017, 33(13): 2113-6. doi:10.3969/j.issn.1006-5725.2017.13.011 |
| [4] |
Hernãn V, Ghiassi-Nejad Z, Rozenfeld R, et al. Autophagy releases lipid that promotes fibrogenesis by activated hepatic stellate cells in mice and in human tissues[J]. Gastroenterology, 2012, 142(4): 938-46. doi:10.1053/j.gastro.2011.12.044 |
| [5] |
Mallat A, Lodder J, Teixeira-Clerc F, et al. Autophagy:a multifaceted partner in liver fibrosis[J]. Biomed Res Int, 2014, 2014(8): 869390. |
| [6] |
Sun H, Zou S, Candiotti K A, et al. Octreotide attenuates acute kidney injury after hepatic ischemia and reperfusion by enhancing autophagy[J]. Sci Rep, 2017, 7: 42701. doi:10.1038/srep42701 |