阿尔茨海默病(Alzheimer′s disease, AD)是一种复杂的慢性神经退行性疾病, 主要表现为记忆力功能性减退及认知功能下降, 并伴有人格和情感障碍等。AD是老年人最常见的痴呆和死亡原因, 影响着全世界4 400万人的健康^[1]。同时, 随着全球社会老龄化的加剧, 其发病率不断上升。目前, 对AD发病机制的认识尚不清晰, 也缺乏行之有效的治疗办法。而随着药物临床试验的不断失败, AD单靶点药物的开发前景越发黯淡^[2]。二十五味珊瑚丸(Byu dMar 25, BM25)作为具有悠久临床应用历史经典藏药验方, 对于AD展现出良好的治疗效果, 并被《中华人民共和国药典》及《中华人民共和国卫生部药品标准》等法定标准所收录^[3-4]。然而, 由于BM25药物配伍及化学组分十分复杂, 其药理作用机制一直难以探究, 阻碍了其在临床上的广泛应用。

此前, 由南开大学、清华大学、江西中医学院与北京藏医院合作完成了BM25的药代动力学研究, 并对于其主要组分及入血成分进行了深入研究^[5]。本文在此基础上, 通过反向药效团匹配法, 对BM25主要入血成分的潜在靶点进行预测, 并结合生物信息学手段, 对以上靶点的所涉主要生物学功能及细胞信号通路进行聚类分析。以系统地探讨BM25抗AD可能的药理作用机制。

1 方法 1.1 化合物数据库的构建

通过查阅文献, 收集BM25的主要入血化合物信息。通过NCBI PubChem数据库检索, 结合ISIS/Draw 2.5软件, 绘制化合物二维结构, 并导出为.mol文件^[6]。随后利用Open Babel 2.4.1软件, 将其转换成三维立体结构, 并输出后缀为.mol2的文件^[7]。

1.2 靶点预测

将BM25入血化合物的立体结构上传至PharmMapper服务器, 采用默认参数对上述配体进行检测^[8]。并利用DGA数据库, 将通过反向分子对接得到的蛋白进行比对, 筛选AD相关靶点蛋白, 通过UniProt数据库, 将蛋白名转换为其编码基因的名称^[9-10]。选择各化合物匹配分数最高的10个靶点所对应的基因进行生物信息学分析。

1.3 生物信息学分析

将上述基因集导入GeneAnalytics软件, 注释各潜在靶标对应基因所涉的生物学功能及分子作用通路^[11]。将化合物名称、靶蛋白对应的基因名称、主要生物学功能及信号通路导入Cytoscape 3.5.1软件, 绘制BM25的药理作用网络^[12]。

2 结果 2.1 BM25主要入血成分的作用靶点预测

文献显示, BM25共有35个主要成分或药物代谢物可从血中检出, 其中包括19个原型药物及16种药物代谢物。由于其中3种化合物与另外3种互为异构体的化合物结构相似度较高, 预测结果基本一致, 因而本文共收集了BM25的32种化合物作为其主要入血成分进行分析, 其中包括19个原型药物及13种药物代谢物(Fig 1)。通过对上述32个化合物进行反向药效团匹配, 以及AD相关靶点的筛选, 并选择各化合物分数最高的10个蛋白作为主要靶点, 得到78个潜在靶点(共320次), 见Fig 2。

2.2 BM25的主要生物学功能及分子信号通路分析

生物信息学分析结果显示, BM25对于AD的潜在靶点所对应的基因, 主要聚类于炎症与免疫(158次)、凋亡与自噬(59次)、β淀粉样蛋白(β-amyloid, Aβ)表达及清除(56次)共3类生物学功能, 以及丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase, MAPK)(130次)、胰岛素(insulin)(124次)、哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin, mTOR)(92次)、cAMP反应元件结合蛋白(cAMP response element-binding protein, CREB)(46次)、缺口蛋白(Notch)(32次)、神经营养因子(neurotrophin)(30次)、神经酰胺(ceramide)(29次)、无翅相关整合位点(wingless-related integration site, Wnt)(8次)及钙离子(calcium)(5次)共9条细胞信号传导通路(Fig 2)。因此推测, BM25可能主要通过作用于MAPK、Insulin及mTOR等分子通路, 发挥其抗炎症、抗凋亡、抗Aβ表达及沉积等药理作用, 进而干预AD的进程。

3 讨论

自1906年发现首例AD患者至今已经百余年, 虽然人类对AD的发病机制有了不断深入的了解, 然而其发病机制仍不明确, 仍缺乏有效的治疗方法。目前, FDA共批准5种治疗AD的药物用于临床, 其中4种为乙酰胆碱酯酶抑制剂(actylcholinesterase inhibitor, AChEI)类药物, 另一种为NMDA受体激动剂。然而, 没有任何一种药物对于AD进程有逆转或延缓的作用。目前, 临床上主要采用社会心理及家庭看护干预手段, 配合AChEI类药物及神经保护因子缓解AD症状。随着干细胞技术的兴起, 以及炎症与免疫学说的出现等, 神经干细胞治疗与免疫细胞治疗也愈发受到重视。然而, 目前仍未有具有明确应用前景的、能够有效治疗AD的单靶点药物出现, 而具有多效性特点的传统药物在AD治疗中的应用, 则受到了越来越多的关注^[2]。

整体观和辨证论治是包括藏医学在内的传统医学的普遍特征。对于复杂的慢性病的治疗, 采用传统医药手段往往能够收获更好的效果。然而, 由于传统药物通常成分十分复杂, 且每一种化合物往往能够调控多个靶点, 因此通过常规的单一药物对单一靶点的经典研究方法, 很难理清传统药物复杂的作用网络, 而作用机制不明也成为其广泛临床应用的最大阻碍之一。近年来, 随着系统生物学和生物信息学等学科的快速发展, 网络药理学作为一种新的研究模式, 被引入天然活性化合物的筛选及多效性药物的药理机制研究中。其主要研究目的为探讨药物组分与靶点之间的相互作用网络, 其核心研究内容为收集药物组分信息, 并通过结构生物学与计算化学的方法, 研究各组分潜在作用靶点, 进而通过生物信息学手段, 分析其分子调控网络及潜在的药理功能。其系统化的研究方法与传统医学的整体论思想殊途同归, 尤其适合阐明复杂药物及复杂疾病间的相互关系。因此, 网络药理学正逐渐成为传统药物研究中的有力工具, 用于分析药物作用机制、天然活性化合物或活性成分群的筛选, 以及新适应症的发现等工作。

BM25是由18世纪藏医药学名家帝玛尔·丹增彭措研制, 并沿用至今的用于包括AD在内的神经系统疾病的经典验方。由珊瑚、珍珠、珍珠母、青金石、朱砂、龙骨、炉甘石、磁石、脑石、麝香、木香、丁香、沉香、红花、诃子、禹粮土、芝麻、葫芦、獐牙菜、紫菀花、西红花、藏菖蒲、打箭菊、榜那及甘草组成^[3-4]。临床研究证实, BM25对于各种神经性疼痛、癫痫、脑卒中、多发性周围神经病等神经系统疾病均具有良好的治疗效果^[13]。动物实验显示, BM25能抑制D-半乳糖诱导的神经元变性和星形胶质细胞的过度激活, HE染色发现, 其能够减轻神经元和星形胶质细胞的损伤, 行为学检测发现其能够改善模型受损的学习、记忆能力, 表明其对于AD也具有潜在的治疗作用^[14]。

本文基于BM25的入血成分, 通过反向药效团匹配法预测其潜在的作用靶点, 并将靶点与疾病进行了关联。确认BM25具有通过作用于不同靶点, 共同发挥抗AD的潜能。此外, 通过对靶点功能的聚类分析发现, BM25抗AD的药理作用机制可能与调控MAPK、Insulin及mTOR等细胞信号传导通路, 干预患者脑组织中炎症与免疫、凋亡与自噬、Aβ的表达及清除等生物学功能有关。BM25的药理作用机制在分子水平的实验研究相对较少, 主要包括杜文兵等^[13]发现, BM25能够降低偏头痛大鼠模型血浆中神经递质NO和一氧化氮合成酶(nitric oxide synthase, NOS)的含量; Liu等^[15]报道, BM25能够抑制人神经母细胞瘤细胞SHSY-5Y中磷酸化NF-κB p65的水平。而根据网络药理学分析结果, BM25的入血成分具备与NOS及p65的磷酸化直接相关的糖原合成酶激酶(glycogen synthase kinase, GSK)-3β的潜能, 可见文中分析结果具备一定的可信度和参考价值。然而, 限于网络药理学的特点, 以及相关研究的缺乏, 其真实的药理作用仍需要通过实验手段进行证实, 但本研究对于相关基础及临床实验的设计及开展能够起到一定程度的指导作用。

( 致谢: 本研究在北京协和医学院图书馆完成。)