糖尿病肾病(diabetic nephropathy, DN)是糖尿病患者最常见且最严重的并发症之一，相关证据表明，炎症是DN病理学的重要特征[1]。巨噬细胞介导免疫炎性反应，通过增加促炎因子和趋化因子，加速DN的进展，抑制这些因子可以减少肾脏损伤[2]。JAK2/STAT3信号途径是一个高度进化保守的途径，参与生长发育、细胞间的通信，与Ras、MAPK等信号通路存在交互作用，可以增强巨噬细胞中肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor alpha, TNF-α)、白细胞介素1β(interleukin 1β, IL-1β)、单核细胞趋化因子1(monocyte chemoattractant protein 1, MCP-1)和促炎细胞因子诱生型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase, iNOS)基因转录水平。Brosius等[3]报道了在DN患者中，JAK2/STAT3基因表达相比于正常组明显升高。芍药苷(paeoniflorin, PF)是白芍总苷(total glucosides of paeony, TGP)主要活性成分。课题组前期研究表明，TGP在糖尿病动物模型中可抑制肾脏JAK2/STAT3信号通路的激活，以及巨噬细胞浸润[4]。本研究在体外探讨PF是否通过JAK2/STAT3信号通路，抑制高糖(high glucose，HG)诱导的巨噬细胞激活，为DN防治提供新思路。
1 材料与方法 1.1 材料 1.1.1 细胞株RAW264.7巨噬细胞系，购自中科院细胞库。
1.1.2 试剂DMEM培养基、胎牛血清(FBS)(加拿大WISENT)；D-葡萄糖、甘露醇(美国Sigma公司)；CCK-8试剂盒(南京诺唯赞生物科技)；反转录试剂盒(美国Promega公司)；实时荧光定量PCR试剂盒(美国Bio-Rad公司)；实时荧光PCR引物(上海生工、美国GeneCopoeia)；兔抗p-JAK2、JAK2、p-STAT3、STAT3抗体(美国CST公司)；小鼠抗β-actin单克隆抗体、辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG或羊抗小鼠IgG(武汉三鹰)；增强化学发光(ECL)试剂盒(美国Thermo Scientific公司)；小鼠TNF-α、小鼠IL-1β ELISA试剂盒(美国R&D公司)；小鼠MCP-1 ELISA试剂盒(北京瑞博奥科技)。
1.1.3 仪器细胞培养箱(美国Thermo公司)，超净工作台(苏州市苏信净化设备厂)，冷冻高速离心机(德国Eppendorf公司)，台式冷冻离心机(德国Backman公司)，酶标仪、梯度PCR仪、荧光定量PCR检测系统(美国Bio-Rad公司)。
1.2 方法 1.2.1 PF细胞毒性检测将RAW264.7细胞以1×104个/孔接种于96孔板中，不同浓度PF(10-8~10-3 mol·L-1)孵育细胞24 h，10 μL CCK-8试剂混合到每个孔中，再培养4 h。酶标仪测量490 nm处的吸光度，对照组细胞中的平均光密度值设定为100%生存力，处理结果表示为对照的百分比。
1.2.2 siRNA转染JAK2、STAT3 6条siRNA由广州锐博生物科技有限公司设计合成，序列见Tab 1。参考Invitrogen公司LipofectamineTM2000转染说明书操作：用无血清培养基稀释siRNA至浓度50 nmol·L-1，取1 μL LipofectamineTM2000稀释于50 μL培养基中，室温孵育5 min，将上述混合，室温静置20 min。将细胞接种至24孔板培养孔中，使转染时细胞密度达30%~50%，在每孔细胞中加入100 μL转染液，37 ℃培养48 h后，Western blot分别检测细胞JAK2和STAT3表达量，筛选出干扰效率最高的siRNA进行后续实验。
| Product number | Product name | Target sequence(5′-3′) |
| siB160617035330 | si-m-JAK2_001 | GGAATGGCCTGCCTTACAA |
| siB160617035340 | si-m-JAK2_002 | GCTGTCATCCGTGATCTTA |
| siB160617035348 | si-m-JAK2_003 | GCAAATGATTGTGTTCCAT |
| siB08425165726 | si-m-stat3_001 | CTGGATAACTTCATTAGCA |
| siB1172594637 | si-m-stat3_002 | CCTCCAGGACGACTTTGAT |
| siB13121293058 | si-m-stat3_003 | GGACGACTTTGATTTCAAC |
RAW264.7细胞用低糖(low glucose，LG)DMEM培养基，于37 ℃、5% CO2和完全饱和湿度的细胞培养箱中常规培养，生长达80%融合的细胞，按照1×106个/孔细胞接种于6孔板, 同步化培养(糖浓度为5 mmol·L-1)24 h后，分9组进行处理：LG(5 mmol·L-1)、HG(25 mmol·L-1)、HG+PF、LG+JAK2 siRNA、JAK2 siRNA+HG、JAK2 siRNA+HG+PF、LG+STAT3 siRNA、STAT3 siRNA+HG、STAT3 siRNA +HG+PF。其中，siRNA转染48 h后，加HG刺激24 h，PF(10-5 mol·L-1)预先干预细胞30 min，再加HG(25 mmol·L-1)刺激24 h。
1.2.4 Western blot检测收集细胞，冰上裂解后提取总蛋白，测定各组蛋白浓度。每个蛋白样品取40 μg上样，经8%~12% SDS-PAGE电泳，恒流转至硝酸纤维素膜上，5%脱脂牛奶37 ℃封闭2 h，加一抗JAK2(1 :1 000)、p-JAK2(1 :1 000)、STAT3(1 :1 000)、p-STAT3(1 :1 000)、β-actin(1 :35 000)，4 ℃孵育过夜，PBST洗膜后，加入辣根过氧化物酶标记二抗(1 :8 000)，37 ℃孵育45 min，PBST洗膜后，ECL显影、曝光。用Western blot条带光密度进行比较分析。
1.2.5 MCP-1趋化实验用无血清培养基同步化培养细胞24 h。将收集细胞接种于Transwell小室中，每孔1×105个细胞，培养基50 μL，按照实验分组，在各组的Transwell下室中分别加入重组小鼠MCP-1，终浓度为20 μg·L-1，培养24 h。吸弃上清，Transwell上室放入预冷乙醇中固定20 min，切去上室底部薄膜，结晶紫染色，轻铺于载玻片上，显微镜下拍照，然后用PBS溶液漂洗2次，薄膜置于33%的冰醋酸中，回收结晶紫染色液，酶标仪570 nm测定各组OD值。
1.2.6 实时定量PCR使用TRIzol试剂提取各组细胞总RNA，以RNA为模板反转录成cDNA。实时定量PCR采用SYBR Green法。GAPDH引物序列上游引物：5′-ACCCCAGCAAGGACACTGAGCAAG-3′，下游引物：5′-GGCCCCTCCTG-TTATTATGGGGGT -3′；TNF-α引物序列上游引物：5′-CCCTCCTGGCC-AACGGCATG -3′，下游引物：5′-TCGGGGCAGCCTTGTCCCTT -3′。下列引物由Gene-Copoeia公司合成：MCP-1：货号MQPO27672; IL-1β：货号MQPO27422; iNOS:货号MQPO29793。反应条件为：95 ℃预变性10 min，进入循环；95 ℃ 15 s, 60 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，扩增35个循环；每组设3个复孔，采用2-△△Ct法分析相对表达量。
1.2.7 ELISA法检测培养上清液细胞因子含量实验结束后，吸取各组细胞培养上清液，5 000 r·min-1、4 ℃离心10 min，吸取上清液，-80 ℃保存。ELISA试剂盒测定培养基中TNF-α、IL-1β、MCP-1含量。
1.2.8 统计学分析符合正态分布的计量资料均用x±s表示，两组间均数比较用t检验，多组均数检验采用单因素方差分析(One-way ANOVA)，组间比较采用LSD法，用SPSS 19.0统计软件进行分析。
2 结果 2.1 PF对巨噬细胞活性的影响为了研究PF对HG刺激下巨噬细胞活性的影响，将RAW264.7细胞用不同浓度PF干预24 h后，CCK-8法检测细胞活性。如Fig 1所示，与没加PF的对照组相比，10-8~10-4 mol·L-1 PF未表现出对巨噬细胞的毒性(P > 0.05)。PF(10-8 ~10-4 mol·L-1)干预24 h对巨噬细胞活性无影响，可用于后续的实验研究。
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| Fig 1 Viability analysis of RAW264. 7 cells after treatment with paeoniflorin(x±s, n=3) *P < 0.05 vs LG group |
将细胞通过不同的处理分组：没有转染的细胞(control组)；加入Lipo 2000(control+lipo组)；转染阴性对照siRNA载体(control+siRNA control组)；转染Lipo2000+靶基因siRNA(control+siRNA组)。Fig 2的Western blot结果显示，JAK2 siRNA转染中，siRNA3片段干扰后的JAK2蛋白表达量减少最明显；STAT3 siRNA转染中，siRNA3片段干扰后的STAT3蛋白表达量减少最明显(P < 0.01)，即沉默效果最好。
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| Fig 2 Expression of JAK2, STAT3 protein determined by Western blot in RAW264.7 macrophages transfected with siRNA(x±s, n=3) 1:Control; 2:Control+lipo; 3:Control+siRNA control; 4:Control+siRNA1;5:Control+siRNA2;6:Control+siRNA3. **P < 0.01 vs control group. |
Fig 3、4的Western blot结果显示，RAW264.7细胞p-JAK2/JAK2、p-STAT3/STAT3水平呈葡萄糖浓度(5、20、25、30、35 mmol·L-1)和时间(0 min、5 min、15 min、30 min、1 h、3 h、6 h、12 h、24 h)依赖性。随葡萄糖浓度增加，JAK2、STAT3蛋白磷酸化水平增加，均在25 mmol·L-1达高峰；蛋白磷酸化程度随时间延长而升高，p-JAK2/JAK2在15 min达到高峰，p-STAT3/STAT3在24 h达到高峰(P < 0.01)。甘露醇作为高糖的渗透压对照，对JAK2、STAT3的磷酸化无影响。
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| Fig 3 Effects of HG with different concentrations on p-JAK2, p-STAT3 protein expression in RAW264.7 macrophages(x±s, n=3) *P < 0.05, **P < 0.01 vs low glucose group(5 mmol·L-1) |
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| Fig 4 Effects of HG with different time on p-JAK2, p-STAT3 protein expression in RAW264.7 macrophages(x±s, n=3) *P < 0.05, **P < 0.01 vs control group(0 h) |
PF干预细胞30 min后，用HG刺激细胞，Fig 5的Western blot结果表明，与HG组相比，p-JAK2/JAK2、p-STAT3/STAT3水平呈PF浓度(10-8、10-7、10-6、10-5、10-4 mol·L-1)依赖性，当PF的浓度为10-5 mol·L-1时，可明显降低上述磷酸化水平(P < 0.05，P < 0.01)。
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| Fig 5 Effects of PF on p-JAK2/JAK2, p-STAT3/STAT3 protein in HG-induced RAW264.7 macrophages determined by Western blot(x±s, n=3) *P < 0.05 vs LG group; #P < 0.05, ##P < 0.01 vs HG group |
Fig 6趋化实验显示，HG刺激可以增加MCP-1对RAW264.7细胞的趋化，导致巨噬细胞迁移。JAK2/STAT3 siRNA组巨噬细胞趋化与LG组间差异无统计学意义, HG组细胞迁移相比LG组明显增加(P < 0.01)；与HG组相比，JAK2 siRNA+HG组、STAT3 siRNA+HG组无差异，HG+PF组细胞迁移明显减少(P < 0.01)；与JAK2/STAT3 siRNA+HG组相比，PF干预可降低MCP-1诱导的巨噬细胞趋化和迁移(P < 0.01)。
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| Fig 6 RAW264.7 macrophages' invasion and migration through MCP-1 determined by Transwell chamber assay(A), and OD value detection of migration cell crystal violet staining solution (B) (x±s, n=3) 1:LG; 2:LG+JAK2 siRNA; 3:LG+STAT3 siRNA; 4:HG; 5:HG+PF; 6:JAK2 siRNA+HG; 7:JAK2 siRNA+HG+PF; 8:STAT3 siRNA+HG; 9:STAT3 siRNA+HG+PF; **P < 0.01 vs LG group; ##P < 0.01 vs HG group; △△P < 0.01 vs siRNA group |
实时定量PCR和ELISA结果显示(Fig 7、8)，HG刺激可明显增加RAW264.7细胞中iNOS和炎症因子(TNF-α、IL-1β、MCP-1)mRNA水平，以及细胞培养液中炎症因子的分泌(P < 0.01)。与HG组比较，JAK2/STAT3 siRNA和PF干预可降低iNOS及炎症因子(TNF-α、IL-1β、MCP-1)mRNA水平和炎症因子的分泌(P < 0.01)，即抑制HG刺激RAW264.7细胞的促炎反应。PF可在基因沉默基础上，进一步下调炎症因子的水平(P < 0.01)。
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| Fig 7 Expression of iNOS, TNF-α, IL-1β and MCP-1 mRNA determined by real-time PCR in RAW264. 7 macrophages(x±s, n=3) 1:LG; 2:LG+JAK2 siRNA; 3:LG+STAT3 siRNA; 4:HG; 5:HG+PF; 6:JAK2 siRNA+HG; 7:JAK2 siRNA+HG+PF; 8:STAT3 siRNA+HG; 9:STAT3 siRNA+HG+PF; **P < 0.01 vs LG group; ##P < 0.01 vs HG group; △△P < 0.01 vs siRNA group |
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| Fig 8 Levels of TNF-α, IL-1β and MCP-1 measured by ELISA in cell supernatant(x±s, n=3) 1:LG; 2:LG+JAK2 siRNA; 3:LG+STAT3 siRNA; 4:HG; 5:HG+PF; 6:JAK2 siRNA+HG; 7:JAK2 siRNA+HG+PF; 8:STAT3 siRNA+HG; 9:STAT3 siRNA+HG+PF; *P < 0.05, **P < 0.01 vs LG group; ##P < 0.01 vs HG group; △△P < 0.01 vs siRNA group |
Fig 9的Western blot结果显示，HG刺激增加RAW264.7细胞中p-JAK2/JAK2、p-STAT3/STAT3水平。与HG组相比，HG+PF组JAK2、STAT3蛋白磷酸化水平明显降低(P < 0.01)。与JAK2/STAT3 siRNA+ HG组相比，PF干预可同时降低JAK2、STAT3蛋白磷酸化水平(P < 0.01)。
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| Fig 9 Expression of p-JAK2/JAK2, p-STAT3/STAT3 protein determined by Western blot in RAW264.7 macrophages(x±s, n=3) 1:LG(5 mmol·L-1); 2:HG(25 mmol·L-1); 3:HG+PF; 4:LG+JAK2 siRNA; 5:JAK2 siRNA+HG; 6:JAK2 siRNA+HG+PF; 7:LG+STAT3 siRNA; 8:STAT3 siRNA+HG; 9:STAT3 siRNA +HG+PF. *P < 0.05, **P < 0.01 vs LG group; ##P < 0.01 vs HG group; △P < 0.05, △△P < 0.01 vs siRNA group. |
PF是一种从芍药根提取的单萜糖苷，已被普遍用于缓解炎症、闭经、腹痛等症状[5]。TGF作为抗炎免疫调节药物可改善类风湿性关节炎患者的病情。炎症也是促进DN发生、发展的关键因素。Fu等[6]研究证实，PF可降低糖尿病大鼠尿蛋白，抑制肾小球肥大，减轻巨噬细胞肾内浸润活化和炎症因子的表达，延缓DN病程进展，但机制不明。
在DN早期阶段，巨噬细胞聚集在肾小球和间质中，肾巨噬细胞积累量与肾小球硬化程度、肌酐血清水平、蛋白尿和间质性纤维化程度密切相关[7]。MCP-1可以趋化巨噬细胞，DN患者肾小管上皮细胞中高表达MCP-1，可使大量巨噬细胞在皮质小管外周聚集，导致DN患者肾脏炎症和纤维化的形成[8]。我们以RAW264.7细胞为研究对象，以MCP-1作为趋化因子，发现HG刺激下巨噬细胞迁移明显增加，而PF干预可抑制HG刺激的巨噬细胞迁移增加。巨噬细胞可以促进炎性反应，产生大量iNOS及炎症因子，促进组织损伤。本实验发现，HG刺激RAW264.7细胞iNOS mRNA的表达，诱导产生大量促炎因子及趋化因子(TNF-α、IL-1β、MCP-1)，而PF干预可以抑制HG刺激的RAW264.7细胞的激活。
JAK/STAT信号通路是介导炎症反应的重要通路之一。细胞因子与JAKs受体结合后，引起受体分子的二聚化，使得与受体偶联的JAKs发生酪氨酸磷酸化，活化的JAKs催化受体本身的酪氨酸残基发生磷酸化修饰，形成相应的STATs停靠位点，使STATs通过SH2结构域与受体结合，并在JAKs的作用下实现其磷酸化，然后入核，并激活相应的基因转录和表达[9]。研究显示，在高脂饮食诱导的小鼠动脉粥样硬化模型中，可通过抑制骨髓来源巨噬细胞内的JAK2/STAT3通路，下调炎症因子的分泌，从而缓解动脉粥样硬化[10]。姜黄素可以抑制JAK2/STAT3激活，减少炎症反应，防治胰腺炎相关肾损伤[11]。已有研究证明，JAK2/STAT3途径的调节与免疫炎症反应密切相关。本研究发现，HG刺激下p-JAK2、p-STAT3蛋白表达明显增加，PF干预可以下调HG刺激的JAK2、STAT3磷酸化水平的升高。JAK2/STAT3 siRNA基因沉默明显下调HG刺激的TNF-α、IL-1β、MCP-1、iNOS mRNA的表达及炎症因子的释放，PF干预与基因沉默的结果相似，表明PF可以通过下调HG刺激的JAK2、STAT3磷酸化水平，从而抑制JAK2/STAT3信号通路发挥抗炎作用。
最近的研究表明，PF可以通过抑制p38、ERK1/2 MAPK和NF-κB信号通路，拮抗血管平滑肌细胞中炎症因子的产生，抑制MCP-1的表达，减轻血管炎症[12]。在HG诱导的糖尿病视网膜病变中，PF可通过抑制TLR4/NF-κB通路，调节视网膜小胶质细胞的炎症反应，这与我们前期在DN中的研究结果相似[13-14]。本研究中，在JAK2/STAT3基因沉默基础上给予PF干预，可以进一步抑制巨噬细胞相关活性因子的产生。趋化实验中，PF干预可以抑制HG刺激下MCP-1对巨噬细胞的趋化迁移，而JAK2/STAT3基因沉默与HG组差异无显著性，推测JAK2/STAT3信号通路可能并不影响巨噬细胞的趋化功能，PF对巨噬细胞激活的调节作用除了通过JAK2/STAT3途径外，还与其他信号通路相关。我们前期的研究发现，PF可以抑制巨噬细胞中TLR2/4通路的激活，抑制巨噬细胞向M1型促炎表型的转化，从而抑制相关炎症因子的表达[14]。PF是否也通过上述p38、ERK1/2 MAPK、NF-κB等信号通路影响巨噬细胞激活，需要进一步研究论证。
综上所述，本研究证明HG刺激了RAW264.7细胞激活，增加巨噬细胞的趋化。而PF干预可明显下调HG刺激产生的效应，其机制可能与抑制JAK2/STAT3信号通路相关，本研究为PF防治DN提供了理论依据。PF对巨噬细胞激活的影响还可能与其他炎症通路相关，仍需进一步探究。
( 致谢: 本实验于安徽医科大学第一附属医院肾内科实验室完成，实验过程中孟晓明教授给予悉心指导与大力支持，在此表示衷心的感谢。)
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