2. 山东中医药大学中医学院,山东 济南 250355;
3. 山东中医药大学中医基础理论研究所,山东 济南 250355
2. School of Traditional Chinese Medicine, Shandong University of Traditional Chinese Medicine, Ji′nan 250355, China;
3. Institute of Basic Theoryof Traditional Chinese Medicine, Shandong University of Traditional Chinese Medicine, Ji′nan 250355, China
经前期综合征(premenstrual syndrome,PMS)系指育龄期女性在月经黄体期,周期性出现的躯体、精神和行为三方面症状的症候群,属情志病症范畴。PMS肝气逆证是其主要亚型之一,以肝疏泄太过、经前烦躁易怒为主要特征[1], 并且“经前出现,经后消失”是该病症典型特点。白芍是促进肝主疏泄,维持正常情志活动的要药。课题组前期研发复方药物白香丹胶囊能有效改善PMS肝气逆证主证烦躁易怒,其中白芍提取物为其君药[2],但是该药在PMS肝气逆证治疗中的作用机制尚不清晰。
苏巧荣等[3]指出,雌激素受体(estrogen receptor,ER)主要是通过5-羟色胺(serotonin, 5-HT)能系统发挥对情绪的调节作用,中枢5-HT活性降低时,机体对应激刺激的敏感性增加,从而引起抑郁或焦虑等负性情绪[4]。Jantarima等[5]发现,雌二醇(estradiol, E2)可通过上调5-羟色胺转运体(serotonin transporter, SERT) mRNA表达,提高5-HT能系统成分含量及转化率,达到治疗去卵巢大鼠焦虑样情绪的目的。另有研究报道,海马在情绪调节及相关情志疾病发病机制中占有重要地位。因此,本研究选择海马作为研究对象,探讨白芍提取物对PMS肝气逆证模型大鼠ERβ及其介导的5-HT能系统中SERT的影响。
1 材料与方法 1.1 实验动物Wistar大鼠,♀,150只,体质量150~180 g,由北京维通利华实验动物技术有限公司提供, 许可证号:SCXK(京)2007-0001。昼夜颠倒(早9:00关灯,晚9:00开灯)适应性饲养1周。
1.2 试剂白芍提取物由青岛海川创新生物天然药物研究中心提供,芍药苷含量35%;盐酸氟西汀胶囊(礼来苏州制药有限公司,国药准字J20130010);ERβ激动剂diarylpropionitrile(DPN)(ab120166)、ERβ兔多克隆一抗(ab3577)、SERT兔多克隆一抗(ab44520),均购于Abcam公司;FITC标记山羊抗兔IgG(H+L)(A0562,上海碧云天生物技术有限公司);TRIzol总RNA提取试剂盒(SK1322,上海生工公司);Oligod(T)18 primers (D511,TaKaRa公司);M-MLV试剂盒(D2639A,TaKaRa公司)。
1.3 PMS电刺激大鼠模型制备 1.3.1 旷场实验[6]本实验采用阴道涂片法筛选动情周期规律大鼠纳入实验。造模前后,采用50 cm×50 cm×40 cm旷场箱和Xmaze动物行为分析系统,记录大鼠3 min内的活动总路程。
1.3.2 动物分组造模及给药将60只合格大鼠,据旷场总路程和大鼠体质量随机分为5组:正常对照组、PMS肝气逆模型组、氟西汀对照组、ERβ激动剂DPN给药组、白芍提取物给药组。造模方法如下:除正常组外,其他各组大鼠均置于ST-A数字脉冲生物刺激仪。电压2 700~3 300 V,脉宽0.3 s,脉冲间隔为白天5 min,夜晚10 min,持续5 d,造模过程中除正常组、模型组同时给予生理盐水外,其余各组给予相应药物。
各组给药情况如下:正常组及模型组给予生理盐水,白芍提取物组灌胃剂量为40 mg·kg-1·d-1[7];氟西汀组给药剂量2.67 mg·kg-1·d-1;激动剂组大鼠皮下注射ERβ激动剂DPN(DPN 40 mg溶于1 mL DMSO涡旋震荡溶解后,再加入19 mL 25% DMSO配制成2 g·L-1 DPN溶液),给药剂量2 mg·kg-1·d-1,各组给药时间5 d,每天1次。于末次给药后30 min, 采用阴道涂片确定动情周期,其中每组6只大鼠用于海马ERβ和SERT mRNA表达测定,另外6只用于海马组织ERβ和SERT的分布和蛋白表达测定。
1.4 海马ERβ和SERT mRNA表达测定各组大鼠断头取脑,继而分离海马组织,立即放入液氮罐中,储存于-70 ℃。采用TRIzol法提取总RNA。取1 μg总RNA,按1 μg/20 μL反应体系逆转录合成cDNA,扩增条件: 94 ℃ 150 s, 预变性;94 ℃ 30 s,变性;(ERβ:61.6 ℃ 40 s;SERT:61 ℃ 40 s;β-actin:59 ℃ 40 s)复性;72 ℃ 1 min延伸;72 ℃ 7 min,再延伸。之后,取8 μL cDNA产物,以1.2%琼脂糖凝胶电泳(含1%绿如蓝DNAgreen)电泳,电压120 V,时间30 min。以目的基因/β-actin为mRNA相对表达量,进行半定量分析。参照Gene Bank大鼠基因序列合成ERβ、SERT和β-actin引物,引物序列见Tab 1[8]。
Gene | Primer sequence | Product size/bp |
ERβ | Forward: 5′-CGTCAGGCACATCAGTAACAAG-3′ | 503 |
Reverse: 5′-GGACAATCCTTCCAAATCAGAC-3′ | ||
SERT | Forward: 5′-CCCTCTGTTTCTCCTGTTCATC-3′ | 421 |
Reverse: 5′-CTGAGAGTCCACGGAAAGAAGT-3′ | ||
β-actin | Forward: 5′-CACCCGCGAGTACAACCTTC-3′ | 207 |
Reverse: 5′-CCCATACCCACCATCACACC-3′ |
各组大鼠用1%戊巴比妥钠(4 mL·kg-1)麻醉, 心脏灌流后取全脑,置于4%多聚甲醛中4 ℃封闭。1周后,进行石蜡包埋,切片(厚约5 μm,切片角度5°)。脱蜡、修复后,滴加正常山羊血清封闭工作液50 μL,室温反应30 min。将ERβ和SERT一抗稀释液50 μL于目标切片上进行孵育,避光滴加FITC标记山羊抗兔IgG二抗50 μL,37 ℃孵育30 min,0.01 mol·L-1 PBS漂洗3次,每次5 min,随后避光滴加抗荧光衰减封片剂,封片4 ℃保存。利用激光共聚焦显微镜(德国ZEISS公司, LSM510型)观察ERβ和SERT在海马CA1、CA3区的分布及表达。每张切片选取3个视野。使用Image-Pro Plus6.0分析数据,并计算相对荧光强度(relative mean fluorescence intensity, RMFI),RMFI=积分光密度(IOD)/图片总面积(area)。
1.6 数据处理利用统计软件GraphPad Prism 6进行数据处理,组间比较采用One-way ANOVA检验。
2 结果 2.1 旷场行为学结果如Fig 1所示,与正常组相比,模型组大鼠自主活动频繁,总路程明显上调(P < 0.01);与模型组相比,白芍提取物干预后,大鼠自主活动趋于正常,总路程明显下调(P < 0.05),与氟西汀和ERβ激动剂组表达一致。
2.2 大鼠海马SERT、ERβ mRNA的表达如Fig 2所示,与正常组相比,大鼠接受期,各组大鼠中枢海马ERβ、SERT mRNA表达均无明显变化(P > 0.05)。在非接受期,PMS肝气逆证模型大鼠中枢海马ERβ mRNA表达明显下调,SERT mRNA表达明显上调(P < 0.01);白芍提取物干预后,明显上调ERβ mRNA表达,下调SERT mRNA表达(P < 0.05),并且与氟西汀和ERβ激动剂组表达一致。
2.3 大鼠海马CA1、CA3区SERT、ERβ的蛋白表达分布如Fig 3所示,大鼠接受期,与正常组和模型组比较,各组大鼠海马CA1、CA3区锥体细胞多为圆状或点状,排列紧密,差异均有显著性;ERβ、SERT的RMFI差异无显著性(P > 0.05)。大鼠非接受期:与正常组比较,模型组大鼠海马CA1、CA3脑区锥体细胞排列不规则,ERβ阳性细胞数和RMFI均明显下降(P < 0.01,P < 0.05);SERT阳性细胞数和RMFI均明显升高(P < 0.01,P < 0.05);与模型组比较,白芍提取物干预后细胞形态趋于正常,ERβ的RMFI明显升高(P < 0.01,P < 0.05),SERT的RMFI明显下降(P < 0.01,P < 0.05),并且与氟西汀和ERβ激动剂组表达一致,差异无显著性。
3 讨论PMS发病机制复杂, 目前5-HT作为该病症脑内重要的单胺类神经递质成为研究热点之一,SERT作用于5-HT转运过程,对脑内5-HT水平起到调控作用。动物遗传学的研究结果证实,脑内单胺转运蛋白的功能与行为学表现及情绪状态密切相关。完全丧失SERT功能的基因敲除小鼠表现出5-HT综合征样行为、焦虑抑郁样行为、焦虑抑郁样症状及社交障碍[9]。
诸多研究表明,ER对情绪没有直接调节作用,而是通过5-HT能系统与GABA能系统间接实现的。5-HT能系统中SERT主要功能是将5-HT转运到脑及外周组织的相关受体而发挥作用,因此,SERT功能异常会导致5-HT及其受体相应功能异常,进而出现焦虑、恐惧、抑郁等消极情绪障碍。有研究显示,ERβ基因敲除小鼠易烦躁易怒、焦虑不安[10]。Walf等[11]研究发现,雌激素可作用于海马和杏仁核的细胞内ER,发挥抗焦虑的作用。也有文献报道[12],雌激素可调节海马CA1区突触发生。另有研究发现[13],雌激素可引起去卵巢恒河猴SERT mRNA在中缝背核的表达明显下降,SERT mRNA阳性细胞的数量也明显减少。因此,说明雌激素及其受体能够介导5-HT能系统功能。
本研究采用改进的情志刺激为主的多因素造模法,主要通过电刺激复制PMS肝气逆证大鼠模型,将非接受期大鼠置入可调式电刺激笼内,在减少电击造成的躯体伤害的同时加强心理性应激[14],利于模型的成功复制。旷场实验可用来评判动物焦虑和抑郁状态[15]。本研究结果显示,大鼠在非接受期,模型组活动总路程明显升高,说明PMS肝气逆证模型大鼠表现出焦虑样行为。给予白芍提取物后,活动总路程明显较少,说明白芍提取物可明显改善PMS肝气逆证引起的负性情绪。
基因检测结果显示,大鼠动情接受期,各类指标并无明显变化。在非接受期,PMS肝气逆证模型大鼠海马ERβ mRNA表达明显降低,SERT mRNA明显上调;海马CA1、CA3区锥体细胞排列杂乱,ERβ阳性细胞数目减少,RMFI明显下降,SERT阳性细胞数目增多,RMFI明显升高,给予白芍提取物后的细胞形态趋于正常。以上研究结果与本研究所得模型大鼠海马区ERβ mRNA和蛋白表达均明显下降,SERT mRNA和蛋白表达升高均一致。提示白芍提取物可能具有雌激素样作用,或者能够通过改善中枢海马ERβ的功能,继而纠正5-HT能系统中SERT的功能,最终起到调整PMS肝气逆证烦躁易怒等主要症状的作用。
综上所述,采用情志刺激为主多因素造模法可以成功制备PMS肝气逆证大鼠模型,模拟PMS主要特征“经前出现,经后消失”。通过该模型的研究,初步证明PMS肝气逆证的发病机制可能与大鼠海马ERβ、SERT的蛋白表达和mRNA的改变有关。白芍提取物有可能发挥雌激素样作用,通过改善海马区ERβ和SERT的表达,起到调节PMS肝气逆证负性情绪的作用。但是白芍提取物雌激素样作用及其具体机制尚需进一步探讨。
(本实验是在山东中医药大学中医基础理论研究所完成,感谢该研究所及情志病证创新研究团队所有同仁的支持和帮助)
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