2-甲氧基雌二醇(2-methoxyestradiol，2-ME2)是一种雌性激素类药物，为17β-雌二醇体内生理代谢物。2-ME2能够不依赖雌激素受体而选择性杀伤肿瘤细胞，并且对正常细胞无毒性[1-4]，根据2-ME2的这些药效特点，该药被普遍用于抗癌基础实验方面的研究。体外实验研究表明，2-ME2可抑制许多不同组织来源的肿瘤细胞生长[2]，动物体内的模型研究结果同样表明，2-ME2可明显抑制动物肿瘤模型的体内生长，且可以大幅度消减肿瘤负荷。虽然2-ME2的抗肿瘤相关研究国内外均有文献报道，但关于抗肿瘤方面的机制仍不清楚。早期实验证实，人急性T淋巴细胞白血病CEM细胞对2-ME2具有高度敏感性，表现为体外增殖受到明显抑制，细胞凋亡现象普遍可见[5-6]。为了进一步验证2-ME2是否对耐药相关的急性T淋巴细胞白血病具有杀伤作用，本研究选择耐6-巯基嘌呤的人急性T淋巴细胞白血病细胞6T-CEM作为体外研究的目标细胞，探讨2-ME2对6T-CEM细胞增殖、凋亡等生物学行为的影响及初步机制。
1 材料与方法 1.1 材料 1.1.1 细胞株人来源的急性T淋巴细胞白血病细胞6T-CEM，购自中科院上海细胞库。
1.1.2 试剂RPMI 1640培养液、小牛血清(美国Gibco公司); 2-ME2、二甲基亚砜(DMSO)，购自美国Sigma公司，DMSO配制2-ME2的初始浓度为2 mmol·L-1，保存于4℃冰箱，临用时培养液稀释至所需浓度，药物中DMSO终浓度小于0.1%;MTT，美国Amresco公司产品; Akt、p-Akt(Ser473)、Bcl-2、Bax、procaspase-3兔多抗，均购自美国Cell Signaling Technology公司; 内参蛋白β-actin鼠单抗，购自湖北武汉博士德科技公司; 蛋白酶抑制剂，购自上海康成生物工程公司; 化学发光底物相关试剂、辣根过氧化物酶(HRP)标记的二抗，均购自美国Pierce公司。
1.1.3 仪器FAX2100型酶标仪(美国STAT公司); DU640型紫外分光光度仪(美国贝克曼公司); 水平电泳槽(北京东方仪器厂); 垂直电泳槽、转膜仪器(美国Bio-Rad公司)。
1.2 方法 1.2.1 6T-CEM细胞的培养冻存于液氮罐的6T-CEM细胞复苏后，培养于含有10%小牛血清的RPMI 1640培养液中。6T-CEM细胞在5% CO2、37℃条件下培养，每3 d传代1次。实验中所采用的6T-CEM细胞均处在对数生长期。
1.2.2 MTT法观察6T-CEM细胞生长变化6T-CEM细胞按1×108·L-1的密度接种至96孔板，每孔200 μL。2-ME2(0.5、1、2、4、8 μmol·L-1)分别处理6T-CEM细胞，培养24、48 h，每个浓度组均设置3个复孔。实验结束前4 h，向各孔中加入MTT溶液，继续培养4 h，终止培养，离心后吸弃上清液，每孔加入150 μL DMSO，振荡结晶物充分溶解。492 nm和630 nm波长下，酶标仪测定各孔光吸收值。按文献[5]计算抑制率，细胞生长抑制率/%=(1-实验组平均吸光度值/对照组平均吸光度值)×100%。
1.2.3 DNA梯度片段法检测6T-CEM细胞凋亡2-ME2(0、1、2、4 μmol·L-1)处理6T-CEM细胞24 h，离心弃上清液，收集1×106数量级细胞，加入含蛋白酶K的样品裂解液，振荡混匀，充分裂解细胞。50℃水浴箱放置12 h，加入500 μL Tris平衡苯酚，振荡混匀，吸取上清液，加入10 mmol·L-1醋酸铵和无水乙醇，颠倒混匀，沉淀DNA -20℃过夜。离心后，吸弃上清液，自然风干DNA，立即加入蒸馏水溶解DNA，40 V电压下，于2%琼脂糖凝胶电泳3 h后观察结果。
1.2.4 蛋白印迹法检测p-Akt、Akt、Bcl-2、Bax、Procaspase-3的表达处于对数生长期的6T-CEM细胞，加入2 μmol·L-1 2-ME2，培养0、24、48、72 h后，离心收集细胞，加入细胞裂解液，提取细胞总蛋白，于4℃、12 000 r·min-1离心10 min，BCA法蛋白定量。取20 μg的待测蛋白，加入上样缓冲液，99℃蛋白变性5 min，10%~15%的SDS-PAGE凝胶电泳，转移至硝酸纤维素膜。膜放入5%的脱脂牛奶封闭2 h，分别加入待测蛋白一抗，4℃孵育过夜。加入二抗，室温孵育2 h，用TBST缓冲液洗膜3次，每次10 min，利用化学发光试剂进行检测和分析。
1.3 统计学方法使用SPSS 17.0软件分析数据。组间比较采用F检验。
2 结果 2.1 2-ME2对6T-CEM细胞增殖的影响设置2-ME2(0.5、1、2、4、8 μmol·L-1)药物处理组和只加培养液处理的对照组，观察24、48 h两个处理时间点的细胞增殖情况。Fig 1的MTT结果显示，0.5 μmol·L-1 2-ME2作用6T-CEM细胞24 h后，6T-CEM细胞生长受抑，随着药物浓度的增加，细胞生长抑制率也逐渐增强，药物浓度为8 μmol·L-1时，细胞生长抑制率达到80%。不同浓度2-ME2作用6T-CEM细胞48 h后，细胞增殖明显受抑制，细胞增殖抑制率随着药物浓度增高而逐步增加，2 μmol·L-1 2-ME2使6T-CEM细胞增殖抑制率达到50%。提示2-ME2抑制6T-CEM细胞增殖存在着一定的量效、时效关联性。
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| Fig 1 Effects of 2-ME2 on proliferation of 6T-CEM cells in 24 h and 48 h(x±s, n=3) |
2-ME2(1、2、4 μmol·L-1)作用于6T-CEM细胞24 h，DNA Ladder法检测细胞凋亡情况。Fig 2电泳结果显示，1 μmol·L-1的2-ME2处理细胞后，可见到典型的梯状片段，随着2-ME2浓度的增加，仍显示出典型的梯状片段改变，结果表明2-ME2能够诱导6T-CEM细胞凋亡的发生。添加培养液处理的对照组细胞未见DNA片段化现象，表现一完整的DNA基因组，表明对照组6T-CEM细胞无凋亡改变。
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| Fig 2 Effect of 2-ME2 on apoptosis of 6T-CEM cells in 24 h by DNA ladder |
2 μmol·L-1的2-ME2作用6T-CEM细胞0、24、48、72 h后，蛋白印迹法检测细胞内蛋白表达。如Fig 3所示，作用24 h后，与对照组比较，p-Akt蛋白表达呈现下降趋势，随着药物处理时间的延长，其表达水平逐步下降(P < 0.05)，而Akt蛋白表达无明显变化，提示2-ME2抑制6T-CEM细胞增殖的过程涉及了Akt蛋白活化受抑制。如Fig 4所示，抗凋亡蛋白Bcl-2表达随着药物作用时间延长，逐渐下调; 促凋亡蛋白Bax表达则逐渐上调; 随着2-ME2作用时间的延长，Procaspase-3表达水平逐渐下降，考虑存在促凋亡蛋白物质的活化。提示2-ME2诱导6T-CEM细胞凋亡过程中存在着线粒体凋亡途径的激活。
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| Fig 3 Effect of 2-ME2(2 μmol·L-1) on expression of Akt and p-Akt in 6T-CEM cells(x±s, n=3) *P < 0.05 vs control |
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| Fig 4 Effect of 2-ME2(2 μmol·L-1) on expression of Bax, Bcl-2 and procaspase-3 in 6T-CEM cells(x±s, n=3) *P < 0.05 vs control |
2-ME2作为一种人体内雌二醇的内源性的生理代谢产物，有着广泛抗肿瘤效应，并且临床相关的毒副作用非常少，其抗肿瘤活性得到了国内外研究人员的关注。前期大量研究证实，2-ME2对多种非血液淋巴系统恶性肿瘤具有抗肿瘤效果，在血液系统肿瘤方面也显示出良好的抗肿瘤功效[3-7]。急性T淋巴细胞白血病是起源于造血干祖细胞恶性血液病，采取多药化疗的治疗，大多数病患可达到形态学缓解，但大部分病例仍存在复发，且大多数病人容易出现耐药，严重影响这类白血病患者的长期生存率，仍需要寻求新的药物提高总的治疗疗效[8]。在前期研究2-ME2抗急性T淋巴细胞白血病CEM细胞的基础上[5-6]，我们选取CEM耐6-巯基嘌呤细胞系6T-CEM作为研究对象，探讨2-ME2对耐药白血病细胞的影响。实验结果证实，2-ME2不同浓度处理可抑制6T-CEM细胞增殖。2-ME2(1、2、4 μmol·L-1)处理6T-CEM细胞，经过DNA Ladder方法检测到药物处理组细胞DNA密度梯度片段化，提示细胞凋亡的发生，说明2-ME2可通过诱导6T-CEM细胞凋亡，达到抑制其增殖的作用。
有研究报道[9]，2-ME2诱导人宫颈癌细胞凋亡的过程中，涉及Bax/Bcl-2比率的改变。我们前期研究发现[10]，2-ME2诱导人慢性粒细胞白血病K562细胞凋亡的过程中，存在Bcl-2下降，Bax表达升高，Bax/Bcl-2比率改变。Bcl-2和Bax均属于Bcl-2家族成员[11]，通过控制线粒体膜表面上的通透性来改变细胞的归属，如激活细胞色素C释放至细胞质中，通过一系列的生理反应，激活caspase-3，启动线粒体凋亡途径，引起细胞凋亡。本研究结果证实，2-ME2作用各个时间点，可抑制Bcl-2、procaspase-3表达，上调Bax表达。这些结果证实了2-ME2能影响6T-CEM细胞的增殖和凋亡。
细胞内存在多种信号转导通路，这些通路都与细胞的生存、增殖、凋亡等生物学行为密切相关。PI3K/Akt信号可通过影响其下游的多种蛋白效应分子的激活和失活，在维持细胞生命过程中发挥关键的监管作用[12-13]。研究证实，该信号通路的异常激活与肿瘤有很大的关联性[13-14]。该通路在人急性T淋巴细胞白血病中也存在持续活化状态，并参与白血病的发展以及耐药、复发等病理生理过程。表明该通路上的蛋白效应分子可能是抗白血病治疗的靶点之一[15]。前期研究证明，2-ME2可抑制p-Akt表达而影响细胞的生存能力，总Akt表达无改变[11]。表明2-ME2影响K562细胞行为可能与抑制Akt蛋白的活化，进而干扰PI3K/Akt信号通路相关。本研究中，蛋白印迹法观察到6T-CEM经2-ME2处理24 h后，p-Akt表达减少，其表达与药物处理时间具有相关性，而总Akt蛋白表达无改变。提示2-ME2处理6T-CEM细胞后，6T-CEM细胞表现出增殖受抑、发生凋亡，与其干预PI3K/Akt通路有关。因此，今后的研究工作将继续深入探讨2-ME2干扰该信号通路的具体机制。
6T-CEM属于6-巯基嘌呤耐药细胞，多药耐药相关蛋白(multidrug resistance-associated protein, MRP)和P-糖蛋白(P-glycoprotein, P-gp)等异常表达在白血病耐药过程中起重要作用。2-ME2抑制6T-CEM细胞增殖并诱导其凋亡的过程中，是否涉及到对MRP、P-gp等耐药蛋白的作用，有待于进一步研究。
综上所述，本实验结果表明，2-ME2可明显抑制6T-CEM细胞增殖，促进细胞凋亡，其抗白血病作用的机制可能与调节Bcl-2、Bax表达，改变了两者之间的比率，进而激活caspase-3，启动内源性凋亡途径有关。同时，降低p-Akt蛋白表达，干扰PI3K/Akt途径转导也参与了2-ME2影响6T-CEM细胞生物学行为的过程。
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