2. 厦门大学附属东方医院感染科，福建 福州 350001;
3. 福州总医院传染病教研室，福建 福州 350001
2. Dept of Infectious Diseases, Dong'fang Hospital of Xiamen University, Fuzhou 350001, China;
3. Teaching-research Office of Infectious diseases, Fuzhou Genenral Hospital, Fuzhou 350001, China
我国肝癌发病率居全球首位，每年超38万人死于肝癌，约占全球肝癌死亡人数一半[1]。肝癌起病隐匿，发现时多为中晚期，且恶性程度高、侵袭性强，易复发和转移，因此，开发出有效的治疗药物具有重要意义。逆转素(reversine)是一种人工合成的小分子嘌呤类似物，在包括人前列腺癌、宫颈癌、乳腺癌、肺癌等多种肿瘤中均表现出较强的抑制肿瘤细胞生长的作用[2-4]。Reversine的抗癌作用可能与其抑制Aurora激酶的活性有关。D′Alise等[5]发现，reversine可抑制白血病细胞的克隆形成，且对正常细胞的毒性作用较另一种已处于Ⅱ期临床试验阶段的Aurora激酶抑制剂VX-680更小。此外，Hua等[6]在裸鼠成瘤模型上也证实reversine可抑制肿瘤的生长。目前，reversine在肝细胞癌中的影响作用研究较少，本文就reversine对人肝癌HepG2细胞增殖、克隆形成及凋亡的影响进行探究。
1 材料与方法 1.1 试剂与仪器Reversine购于美国MedChemexpress生物科技公司，用二甲基亚砜(dimethyl sulfoxide，DMSO)溶解，储存浓度为10 mmol·L-1，置于-20℃冰箱保存。胎牛血清、DMEM高糖培养基、胰酶购于美国Gibco公司; MTS细胞增殖试剂盒购于美国Promega公司; Annexin V-FITC/PI凋亡检测试剂盒购于南京凯基生物科技公司; 蛋白酶抑制剂、磷酸酶抑制剂、BCA蛋白检测试剂盒、ECL化学发光试剂盒，均购自于美国Millipore公司; 兔抗活化多聚(ADP-核糖)聚合酶[poly(ADP-ribose) polymerases, PARP](D64E10)、Bax(E63)、Bcl-2(E17)、Bcl-xl(E18)抗体，购自美国Cell Signaling Technology公司; 细胞裂解液、鼠抗人β-actin(AC-74)、β-tubulin(b-5-1-2)及辣根过氧化物酶标记的二抗，均购自碧云天公司。酶标仪(美国Thermo Fisher公司); 流式细胞仪(美国BD公司); 冷冻离心机(美国Sigma公司); 凝胶扫描分析系统(印度Syngene公司)。
1.2 细胞与培养人肝癌细胞株HepG2购于美国标准培养物保藏中心(American Type Culture Collection，ATCC)，用含10%胎牛血清的DMEM高糖培养基，置于37℃、5% CO2的条件下培养。用0.25%的胰酶消化。
1.3 细胞增殖能力检测采用MTS实验检测reversine对HepG2细胞增殖的影响。取对数生长期的肝癌细胞制成细胞悬液，按1×104个/孔的密度接种于96孔板中，每孔加入100 μL DMEM高糖培养基置于培养箱中。待细胞贴壁后，每孔加入含不同浓度reversine(0.1、0.2、0.4、0.8、1.6 μmol·L-1)的DMEM高糖培养基100 μL，对照组加入含0.01% DMSO的DMEM高糖培养基100 μL，每组设置6个复孔。分别于培养24、48、72、96 h后，弃原培养基，每孔加入含MTS标记试剂的DMEM高糖培养基(培养基:MTS标记试剂=5 :1)培养2 h。用酶标仪检测并记录在490 nm及690 nm处的吸光度值。使用公式计数出抑制率：抑制率/%=(1-实验组细胞数/对照组细胞数)×100%，并计算出IC50。
1.4 细胞克隆形成能力检测为评估reversine对肝癌细胞HepG2的远期效应，采用克隆形成实验来检测其作用。将HepG2细胞消化重悬后计数，于6孔板中每孔接种1 000个细胞。待细胞贴壁后，将各孔更换为含有不同浓度reversine(0.1、0.2、0.4、0.8、1.6 μmol·L-1)的培养基，阴性对照组加入等量DMSO，各组设3个复孔。将细胞放入培养箱孵育2周后，弃上清，用结晶紫染色30 min，PBS冲洗3次，统计克隆形成数目，并比较各组克隆形成的差异。
1.5 流式细胞仪检测细胞凋亡HepG2细胞经不同浓度reversine(0.1、0.2、0.4、0.8、1.6 μmol·L-1)孵育48 h，DMSO作为阴性对照。收集细胞沉淀，用500 μL的结合缓冲液重悬细胞，加入5 μL Annexin V-FITC和5 μL PI混匀，在室温避光条件下孵育15 min，然后采用流式细胞仪进行细胞凋亡率检测。
1.6 Western blot法分析蛋白表达HepG2细胞经不同分组处理后，收集细胞沉淀，用4℃预冷的PBS洗涤3遍，吸弃上清，加入含蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂的细胞裂解液充分混匀，置于冰上裂解30 min。随后于4℃、12 000×g离心10 min，取上清，采用BCA蛋白检测试剂盒进行蛋白浓度测定，并制备成蛋白样品。SDS-PAGE凝胶电泳，电转至PVDF膜。用5%脱脂奶粉封闭1 h，一抗4℃摇床孵育过夜，次日用TBST洗涤3遍。加入TBST稀释的二抗，室温摇床孵育1 h。TBST洗涤3遍，ECL化学发光试剂于凝胶扫描分析仪中检测并分析结果。
1.7 统计学处理所有实验数据均以x±s表示，组间比较采用单因素方差分析，两两比较用LSD检验。
2 结果 2.1 Reversine抑制HepG2细胞的增殖HepG2细胞经不同浓度reversine(0.1~1.6 μmol·L-1)处理后，各组细胞在倒置相差显微镜下观察发现，随reversine浓度增加，细胞密度及细胞状态逐渐下降，圆形悬浮细胞增加，且细胞核有变大趋势(Fig 1A)。MTS检测结果显示，reversine浓度越高，对HepG2细胞增殖的抑制作用越明显，并且呈剂量和时间依赖关系(Fig 1B)。根据MTS实验数据，HepG2的IC50值为0.94 μmol·L-1。
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| Fig 1 Effect of reversine on cell viability of HepG2 cells (x±s, n=3) A: HepG2 cells were treated with different concentrations of reversine; B: HepG2 cells were incubated with different concentrations of reversine for 24, 48, 72, 96 h, and the relation of cell viability was analyzed by MTS. |
Fig 2的克隆形成实验结果显示，HepG2细胞经不同浓度reversine(0.1~1.6 μmol·L-1)处理后，细胞的克隆形成能力明显下降(P＜0.05)，且较高浓度reversine处理组(0.2~1.6 μmol·L-1)的HepG2细胞几乎不能形成肉眼可见的细胞克隆。
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| Fig 2 The colony formation ratio of HepG2 after treatment with different concentrations of reversine (x±s, n=3) A: HepG2 cells were exposed to different concentrations of reversine, colony formation was determined by crystal violet staining; B: Reversine suppressed colony formation in HepG2 cells. **P < 0.01 vs DMSO group. |
HepG2细胞经不同浓度reversine(0.1~1.6 μmol·L-1)处理后，流式细胞仪检测细胞凋亡率。如Fig 3所示，与对照组(DMSO)相比，HepG2细胞的早期凋亡率、晚期凋亡率及总凋亡率均随reversine浓度增加而增加，呈剂量依赖关系。
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| Fig 3 Apoptotic rate of HepG2 cells under different concentrations of reversine (x±s, n=3) A: HepG2 cells were treated with DMSO or reversine, and the appototic cells were assessed by flow cytometry; B: The rates of appotosis in HepG2 cells treated with or without reversine. **P < 0.01 vs DMSO group. |
Fig 4结果显示，随reversine浓度的增加，活化的PARP水平明显增加，说明reversine可以诱导HepG2细胞发生凋亡。同时，促凋亡蛋白Bax的表达增加，而抗凋亡蛋白Bcl-2及Bcl-xL蛋白表达下降，提示reversine诱导HepG2细胞凋亡可能是通过线粒体凋亡途径。
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| Fig 4 Expression of Bcl-2, Bcl-xL, Bax and cleaved-PARP in HepG2 cells after treatment with different concentrations of reversine (x±s, n=3) *P < 0.05, **P < 0.01 vs DMSO group |
肝癌严重危害人类健康，目前以手术为主的治疗方案疗效仍不甚理想。人工合成的小分子嘌呤类似物reversine被发现具有抗肿瘤作用，研究证实reversine可抑制前列腺癌、宫颈癌、白血病、人口腔鳞状细胞癌、甲状腺癌、乳腺癌、非小细胞肺癌、人尿路上皮细胞肿瘤等肿瘤细胞生长。通过对文献回顾所知，目前reversine对肝癌的研究还未见系统报导。原发性肝癌中肝细胞癌占85%~90%，在本研究中，我们探讨了reversine对人肝癌细胞HepG2生长的影响作用。我们通过细胞增殖实验(MTS)、细胞克隆形成实验及细胞凋亡实验，论证了reversine对肝癌细胞HepG2的抑制作用。结果显示，reversine可以明显抑制肝癌细胞HepG2的细胞增殖和克隆形成，并诱导HepG2细胞的凋亡，且与reversine的剂量呈正相关。
PARP具有蛋白修饰和DNA修复功能，在细胞凋亡中起到重要作用[7]。在凋亡过程中，PARP可被活化的caspase-3裂解为两个分子量较小的片段，即可导致损伤DNA无法及时修复，促使细胞凋亡，又为细胞凋亡储备了更多能量。真核细胞核内PARP含量丰富，在凋亡早期就可检测到PARP裂解片段，可作为检测凋亡的指标之一[8]。本研究Western blot检测结果发现，活化的PARP水平增加，从蛋白水平也证实了reversine可以诱导HepG2细胞的凋亡。
线粒体是机体发生凋亡的重要场所，Bcl-2蛋白家族中的促凋亡蛋白Bax和Bak是主要的调控蛋白，可致线粒体外膜透性化，紧接着向胞质内释放细胞色素C和凋亡蛋白酶激活因子，形成凋亡复合体，进一步活化caspase-9、caspase-3和caspase-7，最终细胞降解死亡[9]。Bcl-2蛋白家族的另外两大成分抗凋亡蛋白Bcl-2、Bcl-xL可与促凋亡蛋白Bax和Bak相互作用，参与线粒体凋亡途径[10]。本研究Western blot检测结果显示，Bax的表达增加，抗凋亡蛋白Bcl-2及Bcl-xL表达下降，提示reversine诱导HepG2细胞凋亡可能是通过线粒体凋亡途径。可通过进一步检测caspase-9、caspase-3和caspase-7的表达来验证。
Aurora激酶是有丝分裂过程中关键性调节酶[11]，在哺乳动物中的Aurora激酶包括3个家族成员，即Aurora A、Aurora B、Aurora C。Aurora A主要参与调节中心体成熟和分离，促进有丝分裂纺锤体装配，同时可通过调控cyclin B/CDK1复合物来干预细胞有丝分裂。Aurora B可调控纺锤体稳定性和染色体凝结、排列及胞质分裂。目前关于Aurora C的功能尚无明确的研究证据。多项研究发现，Aurora激酶在包括肝癌等诸多肿瘤中高表达[12-14]，因此，Aurora激酶成为抗肿瘤的重要靶点之一。Reversine作为一种新型Aurora激酶的抑制剂，在肝癌中是否可通过抑制Aurora激酶活性来干预肝癌细胞的有丝分裂，导致肝癌细胞周期阻滞，从而抑制肝癌细胞增殖，有待于进一步探讨。此外，在活体内reversine是否同样可以抑制肿瘤生长，也可通过裸鼠成瘤模型来验证。
综上所述，reversine可以有效抑制肝癌细胞HepG2的增殖和克隆形成，并诱导肝癌细胞发生凋亡，从而抑制肝癌HepG2细胞的生长，但其深入的机制有待于进一步研究。
( 致谢: 本研究是在厦门大学附属东方医院中心实验室完成，在此致以由衷的感谢！)
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