2. 延边大学医学院解剖学教研室，吉林 延吉 133002
2. Dept of Anatomy, School of Basic Medical Sciences, Yanbian University, Yanji Jilin 133002, China
支气管哮喘是最常见的呼吸系统疾病之一，其特点是气道高反应性、气道炎症和气道重塑[1]。在哮喘的发病机制上，学者们常把重点放在气道炎症上，但气道重塑在哮喘的发病过程中也起到非常重要的作用。气道重塑不仅可以引起不可逆的气道阻塞、增加气道阻力、加重气道高反应性，而且可导致肺功能下降，是治疗哮喘的重中之重[2]。气道重塑的病理表现为炎症细胞浸润、气道平滑肌增厚、胶原纤维沉积、肌成纤维细胞增生及血管改变[1]。目前，医疗卫生机构在气道重塑的管理工作上已经做出了不懈的努力，但尚未发现可有效改善气道重塑的治疗药物。因此，研究哮喘气道重塑的发病机理具有重要意义。
转化生长因子β1(transforming growth factor β1, TGF-β1)信号通路广泛存在于胚胎发育、细胞增殖、分化、迁移、凋亡和血管生成中[3]。研究发现，Smad3蛋白是TGF-β家族的直接底物，是配体和受体相互作用的信号由胞质传导到胞核的中介分子[4]。目前研究发现，TGF-β1/Smad3信号通路在支气管哮喘气道重塑的形成过程中起到关键作用，是导致哮喘气道重塑的重要机制之一[5]。据研究报道，PI3K是细胞信号转导通路的重要组成部分，可以活化气道平滑肌细胞的增殖，并可能参与气道重塑的过程中[6]。
欧前胡素(imperatorin, IMP)是一种天然的6, 7-呋喃香豆素类化合物，存在于伞形科植物如独活、当归、欧前胡等常用中药中，并具有抗炎、抗肿瘤、抗惊厥等多种药理作用[7]。研究发现，IMP通过抑制TGF-β1和基质金属蛋白酶2(matrix matalloproteinases 2，MMP-2)的表达来改善肾性高血压诱发的心脏重塑[8]，并且IMP通过阻断PI3K/Akt信号通路，对人类胃腺癌细胞起到抗肿瘤作用[9]。本文拟进一步探讨IMP对哮喘气道重塑的作用，其作用机制是否与TGF-β1/Smad3和PI3K/Akt信号通路相关。
1 材料与方法 1.1 材料 1.1.1 实验动物♀清洁级BALB/c小鼠40只，体质量(18±5)g，购自延边大学实验动物中心，合格证号：SCXK(吉)2017-0003。本研究已获得延边大学医学院伦理委员会的批准，整个实验进程中遵守《实验动物管理条例》。
1.1.2 药物与试剂IMP(MAYA-CR-6162)购自中国玛雅试剂有限公司；双氢罗丹明(DHR)-123试剂盒、卵清蛋白(ovalbumin, OVA)、氢氧化铝粉，均购自美国Sigma公司；DAB及免疫组化试剂盒，IgE、IFN-γ、IL-5、IL-4、IL-13等ELISA试剂盒，均购自北京中杉金桥公司；α平滑肌肌动蛋白(α-smooth muscle actin, α-SMA)(#19245)、MMP-9(#13667)、TGF-β1(#3711)、Smad3(#9523)、phospho-Smad3(#9520)、Akt(#2920)、phospho-Akt(#9611)、β-actin(#4970)抗体，均购自美国Santa Cruz公司。
1.1.3 仪器15K高速冷冻台式离心机(美国Sigma公司)；2135型轮转式切片机(德国徕卡公司)；雾化器(大连医疗器械厂U219)；酶联免疫检测仪RT-2100C(美国雷杜公司)；Western blot转膜仪(Bio-Rad公司)；TXD3细胞涂片离心机(广州泸瑞明仪器有限司)。
1.2 方法 1.2.1 动物分组将40只♀BALB/c小鼠随机分为5组，分别为正常对照组(Control)、OVA气道重塑模型组(OVA)、IMP低、高剂量治疗组(IMP-L、IMP-H)、地塞米松阳性对照组(Dex)，每组8只。
1.2.2 模型的制备[1]每组小鼠饲养1周适应环境。随后d 1、7、14，对照组小鼠每只腹腔注射200 μL生理盐水，而OVA组、IMP-L组、IMP-H组及Dex组均腹腔注射致敏混悬液(OVA 10 μg+氢氧化铝1 mg+200 μL生理盐水)；从d 17开始，OVA组、IMP-L组、IMP-H组及Dex组均雾化吸入激发液(OVA 0.1 g+生理盐水10 mL，1% OVA生理盐水溶液)，每次雾化吸入30 min，每周激发3次，共激发8周，而对照组用等量生理盐水10 mL雾化吸入。从d 17开始给予对照组和OVA组ip二甲基亚砜(dimethyl sulfoxide, DMSO)200 μL，IMP-L、IMP-H组分别腹腔注射稀释于200 μL DMSO中的30、60 mg·kg-1 IMP，地塞米松1 mg·kg-1，每天注射1次(激发时提前1 h给药)。
1.2.3 标本收集最后一次激发后24 h，将小鼠用无水乙醚处死，并固定到手术板，纵切颈部皮肤并充分暴露气管，在气管上剪一小切口插入软管，缓慢注射4℃生理盐水1 mL后缓慢回抽，连续反复3次，保证回抽量在80%以上。将已收集的支气管肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid, BALF)3 000 r·min-1离心5 min，并取上清液，置于-80℃冻存，剩余的沉淀物用于细胞涂片。之后取出右肺置于-80℃冻存，左肺置于4%甲醛中固定。心脏采血1 mL，3 000 r·min-1离心10 min后，取上清液，-20℃保存，用于ELISA检测TGF-β1。
1.2.4 BALF中EOS和总细胞数的检测BALF经离心后的细胞沉渣中，加入生理盐水定容至600 μL，混匀后，取200 μL置入细胞涂片离心机制备细胞涂片。经Diff-Quick染色法，在光学显微镜下进行细胞计数。
1.2.5 BALF中IL-4、IL-5、IL-13、IgE、TGF-β1及血清中TGF-β1的检测根据ELISA试剂盒说明书的步骤，依次检测BALF和血清中TGF-β1的浓度，BALF中IgE、IL-4、IL-5、IL-13的浓度。通过标准曲线计算其浓度。
1.2.6 肺组织学检查将固定后的左肺依次进行脱水、浸蜡、包埋，将蜡块切成厚度为4 μm的薄片，分别进行HE、Masson染色。
1.2.7 免疫组织化学检测将切片置于60℃烤箱内熔蜡，然后进行脱蜡、脱水，并置于100℃的抗体修复液中修复30 min，然后分别用α-SMA一抗和相对应的二抗进行孵育。用DAB染色、苏木精复染后，常规脱水、中性树脂封片并观察。
1.2.8 Western blot检测提取小鼠右肺组织蛋白，根据BCA试剂盒要求测定蛋白浓度。取20 μg蛋白，在10%的SDS-PAGE中以80 V电压电泳。电泳结束后以300 mA、4℃条件下进行转膜。5%的脱脂奶粉封闭液中常温封闭1 h。然后分别孵育小鼠α-SMA、MMP-9、TGF-β1、Smad3、phospho-Smad3、Akt、phospho-Akt、β-actin抗体4℃过夜。常规洗膜后加入相应的二抗，常温摇床孵育2 h。将膜取出后用ECL试剂曝光。
1.3 统计学方法资料的统计分析采用SPSS 17.0，统计图的绘制采用GraphPad Prism 6.0。资料的正态性检验采用D′Agostino-Pearson omnibus normality test以及Komogorov-Smirnov test(with Dallal-Wilkinson-Lilliev for p value)，计量资料的比较采用Kruskal-Wallis test(组间比较采用Dunn′s multiple comparison test)以及One-way ANOVA(组间比较采用Holm-Sidak′s multiple comparisons test)。
2 结果 2.1 IMP抑制炎症细胞的渗出和杯状细胞的增生Fig 1的HE染色结果显示，OVA组较对照组炎症细胞浸润明显增多，且发现在血管及细支气管周围浸润明显，而IMP组中炎症细胞的浸润明显减少，呈剂量依赖性，且Dex组减少最明显。Masson染色结果中，与对照组相比，OVA组中胶原沉积明显增多，IMP-L组中的胶原沉积较OVA组减少，且IMP-H组减少明显，Dex组减少最明显。提示IMP可明显减少炎症细胞渗出和胶原沉积。
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| Fig 1 Exudation of inflammatory cells and collagen deposition reduced by IMP(×200) |
如Fig 2A所示，BALF中OVA组的IL-4、IL-5及IL-13的含量较对照组明显增多(P < 0.05)，且IMP-L组中IL-4、IL-5及IL-13含量较OVA组减少(P < 0.05)，IMP-H组明显减少(P < 0.05)，Dex组减少最明显。如Fig 2B所示，OVA组BALF中总细胞数与EOS的细胞数较对照组明显升高(P < 0.01)。与OVA组相比，IMP-L组BALF中总细胞数与EOS的细胞数均减少(P < 0.05)，且IMP-H组的细胞数减少的更明显(P < 0.05)，Dex组减少最明显(P < 0.05)。如Fig 2C所示，与对照组相比，OVA组明显增加BALF中总IgE和OVA特异性IgE表达(P < 0.05)，而IMP-L组较OVA组总IgE和OVA特异性IgE表达减少(P < 0.05)，且IMP-H组明显减少(P < 0.05)，Dex组减少最明显(P < 0.05)。如Fig 2D所示，BALF中OVA组的TGF-β1浓度较对照组明显增多(P < 0.01)。与OVA组相比，IMP组中TGF-β1浓度明显减少(P < 0.05)，呈剂量依赖性，Dex组减少最明显。提示IMP可有效减少IL-4、IL-5、IL-13、EOS、IgE和TGF-β1的生成。
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| Fig 2 Generation of IL-4, IL-5, IL-13, EOS, IgE and TGF-β1 inhibited by IMP(x±s, n=5) A: The concentration of IL-4, IL-5, IL-13 in BALF; B: The number of EOS in BALF; C: The concentration of IgE in BALF; D: The concentration of TGF-β1 in BALF and serum.*P < 0.05, **P < 0.01 vs control; #P < 0.05, ##P < 0.01 vs OVA |
Fig 3A的免疫组化结果显示，与对照组相比，OVA组中α-SMA阳性面积明显增加，而IMP组较OVA组α-SMA阳性面积明显减少，呈剂量依赖性，Dex组中α-SMA阳性面积减少最明显。Fig 3B的Western blot结果示，OVA组中α-SMA和MMP-9的蛋白表达较对照组明显升高(P < 0.01)，但IMP组较OVA组α-SMA、MMP-9的蛋白表达明显下降，呈剂量依赖性(P < 0.01)，Dex组下降最明显(P < 0.01)。提示IMP可明显减少肺组织中α-SMA和MMP-9的表达量。
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| Fig 3 Expression of α-SMA and MMP-9 in lung tissues down-regulated by IMP A: The positive area of α-SMA in the lung tissues was detected by IHC(×200, scale bar: 4 μm); B: The expressions of α-SMA and MMP-9 in the lung tissues were detected by Western blot(x±s, n=5).*P < 0.05, **P < 0.01 vs control; #P < 0.05, ##P < 0.01 vs OVA |
Fig 4结果显示，OVA组中TGF-β1蛋白表达较对照组明显增加(P < 0.01)，IMP-H组中的TGF-β1蛋白表达较OVA组减少(P < 0.05)，Dex组减少最明显(P < 0.01)。与对照组相比，OVA组中p-Smad3和Smad3的蛋白表达明显增加(P < 0.01)，且IMP组中p-Smad3和Smad3蛋白的表达较OVA组明显减少(P < 0.05)，呈剂量依赖性，Dex组减少最明显(P < 0.05)。以上结果表明，IMP的作用机制可能是通过抑制TGF-β1/Smad3通路来改善哮喘小鼠气道重塑。
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| Fig 4 Protein expression of TGF-β1and Smad3 inhibited by IMP(x±s, n=5) *P < 0.05, **P < 0.01 vs control; #P < 0.05, ##P < 0.01 vs OVA |
如Fig 5所示，OVA组中Akt蛋白表达较对照组明显增加(P < 0.01)，且IMP组中的Akt蛋白表达较OVA组明显减少，IMP-H组减少明显(P < 0.05)，Dex组减少最明显(P < 0.05)。提示IMP的作用机制可能与抑制PI3K/Akt通路有关。
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| Fig 5 Expression of Akt in lungtissues inhibited by IMP(x±s, n=5) *P < 0.05, **P < 0.01 vs control; #P < 0.05 vs OVA |
支气管哮喘是一种普遍存在的全球健康问题，是由多种炎症细胞及炎症介质导致的慢性气道炎症，其中气道重塑是哮喘的重要特征，且气道重塑是以胶原沉积和气道炎症为主要特征[10]。IL-4、IL-5、IL-13等炎症因子是Th2细胞亚群中的主要细胞因子，其通过诱导嗜酸性粒细胞的产生、聚集、活化、脱颗粒，且辅助B细胞产生IgE来介导I型变态反应[11]。研究发现，EOS会大量浸润在哮喘气道中，且分泌嗜酸性粒细胞阳离子蛋白(eosinophil cation protein, ECP)，进而诱导成纤维细胞分泌TGF-β1，促使成纤维细胞转化成为肌成纤维细胞，并分泌大量细胞外基质，引起气道壁增厚，最终导致气道重塑，而且EOS与PI3K/Akt信号通路也密切相关[12]。本文HE染色、Masson染色结果显示，IMP明显减少胶原纤维的沉积，以及血管和支气管周围的炎症细胞的浸润。IMP组可明显减少BALF中EOS细胞数和IL-4、IL-5、IL-13、IgE的含量，并且减少BALF及血清中TGF-β1的含量，呈剂量依赖性。以上结果表明，IMP可能对小鼠哮喘气道重塑有明显的抑制作用。
α-SMA在气道平滑肌收缩过程中起关键作用，且与气道重塑密切相关。提高α-SMA的水平可促进平滑肌细胞的增殖和迁移，这对气道重塑起到至关重要的影响[13]。研究发现，MMP-9与气道壁的胶原沉积相关，这可能会引起气道狭窄。本文免疫组化结果显示，IMP组可抑制α-SMA的阳性面积，且IMP剂量越大，抑制越明显。而且Western blot结果显示，IMP组较OVA组明显抑制α-SMA、MMP-9的蛋白表达量，呈剂量依赖性。以上结果说明IMP可能通过抑制α-SMA与MMP-9的表达，来改善气道重塑。
本文进一步探讨IMP改善气道重塑的分子机制是否与TGF-β1/Smad3通路和PI3K/Akt通路有关。TGF-β1是气道重塑中的一个关键因素，它主要通过平滑肌细胞增生及肥大来导致气道平滑肌功能异常，进而导致气道重塑。Smad3蛋白家族已被证实为TGF-β1受体的关键底物之一，是TGF-β1受体复合物的下游信号调节蛋白，在诱导TGF-β1信号从细胞表面转入到细胞核的过程中起到重要作用[14]。目前研究发现，PI3K/Akt的酶活性在OVA诱导的小鼠哮喘模型中明显增加，在PI3K缺失的小鼠哮喘气道重塑模型中发现气道炎症和气道重塑明显减少[15]，表明PI3K/Akt信号通路在气道重塑的形成中起到重要的作用。本研究发现，IMP组与模型组比较，可有效抑制TGF-β1、p-Smad3、p-Akt蛋白表达。以上结果说明IMP可能通过TGF-β1/Smad3和PI3K/Akt双通路来改善气道重塑。
综上所述，IMP通过减少肺组织中胶原沉积、炎症细胞浸润和抑制EOS、IL-4、IL-5、IL-13、IgE、TGF-β1的生成，来改善气道重塑，并进一步证实其作用机制可能部分与TGF-β1/Smad3和PI3K/Akt双通路相关。
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