2. 华北理工大学临床医学院，河北 唐山 063000;
3. 华北理工大学冀唐学院，河北 唐山 063000;
4. 华北理工大学基础医学院，河北 唐山 063000;
5. 河北省慢性疾病重点实验室，唐山市慢性病临床基础研究重点实验室，河北 唐山 06300
2. School of Clinical Medicine, North China University of Science and Technology, Tangshan Hebei 063000, China;
3. School of Jitang, North China University of Science and Technology, Tangshan Hebei 063000, China;
4. School of Basic Medical Science, North China University of Science and Technology, Tangshan Hebei 063000, China;
5. Hebei Key Lab on Chronic Diseases and Tangshan Basic Clinical Diseases, Tangshan Hebei 063000, China
2型糖尿病的发展会导致多种并发症，肝损伤是其中之一[1-2]。肝脏与糖脂代谢密切相关[3]，探究保护糖尿病肝损伤的作用机制，对于糖尿病的治疗和预后都很重要。
D-手性肌醇(D-chiro-inositol，DCI)是羟基环己醇的一种手性结构，具有促进肝脏脂代谢、胰岛素增敏、降血糖、抗氧化等作用[4]，有希望应用于2型糖尿病的临床治疗[5]。目前，已有文献对DCI降低血糖的机制进行初步探究，表明DCI通过作用于PI3K/Akt信号通路，降低Ⅱ型糖尿病大鼠的血糖[6]。另有研究表明，DCI可以通过抑制肝糖输出(hepatic glucose output，HGO)，在体内发挥抗糖尿病作用[7]。但国内外还未见有关DCI对糖尿病肝脏保护作用机制的研究报道。本实验通过给予db/db小鼠不同剂量DCI，观察DCI的降糖作用及其对肝损伤的抑制作用，并探讨可能机制，为DCI进一步研发和应用提供实验依据。
1 材料 1.1 实验动物35只10周龄♀SPF级db/db小鼠(体质量39~48 g)，10只同源同周龄♀ db/m小鼠(体质量17~20 g)，购自常州卡文斯实验动物有限公司，许可证号：SCXK(苏)2016-0010，饲养于华北理工大学动物实验中心SPF级实验室。60Co辐射小鼠颗粒饲料(南京贝斯弗饲料有限公司，生产批号：20171050001MF01)。
1.2 药物与试剂DCI(Sigma公司，Lot：#BCBQ3950V，货号：101678071，白色结晶，纯度99%)；天门冬氨酸氨基转移酶(aspartate aminotransferase，AST)和丙氨酸转氨酶(alanine amino-transferase, ALT)测定试剂盒(南京建成生物工程研究所，货号C010-2、C009-2)；葡萄糖转运蛋白4 (glucose transporters 4，GLUT4)抗体(武汉博士德公司，货号：BM2162)；胰岛素受体底物2(insulin receptor substrate 2，IRS2)抗体[EPR904(2)](Abcam公司，货号：ab134101)；胰岛素受体(insulin receptor，IR)抗体(Gene Tex公司，货号：GTX101136)；BCA蛋白浓度测定试剂盒(北京雷根生物技术有限公司，货号：PT0001)；Masson染色试剂(索莱宝科技有限公司，批号：20160913)。
1.3 仪器罗氏血糖仪及配套血糖试纸(德国罗氏诊断有限公司)；200PRO酶标仪(瑞士Tecan公司)；Universal Hood Ⅲ凝胶成像分析系统(美国伯乐)；5180R高速低温离心机(Eppendorf公司)；HMIAS-2000真彩病理图像分析系统(高腾科技有限公司)；BX5光学显微镜(日本Olympus公司)；RM2245轮转式切片机(Leica公司)；H-7650透射电镜(日本日立公司)。
2 方法 2.1 小鼠分组与给药将小鼠适应性饲养1周，测定随机血糖值，连续2次血糖均值>16.1 mmol·L-1的纳入实验，选取符合要求的30只小鼠(剔除血糖和体质量差异较大的小鼠)，随机分为模型对照组(MCG)、高剂量DCI组(HDCI)和低剂量DCI组(LDCI)；db/m为正常对照组(NCG)。每组10只。HDCI与LDCI给药量分别70、35 mg·kg-1·d-1，MCG与NCG给予同体积纯水。于每日上午9时按照体质量分别灌胃，持续6周。
2.2 观察指标 2.2.1 一般表征观察给药期间密切观察小鼠的精神状态、活动、毛色及大小便等有无改变。每周测定小鼠的饮水量、进食量和体质量变化。
2.2.2 血糖测定首次给药血糖动态观察：用血糖仪测定第1次给药前及给药后禁食0、1、2、4 h的血糖。随机血糖测定：于给药0周、2周、4周、6周，测定db/db小鼠随机血糖(给药后2 h)。
2.2.3 血清AST、ALT和肝重指数测定末次给药后，禁食14 h，吸入性七氟烷麻醉(将小鼠口鼻对准含七氟烷瓶口约5~6 s)小鼠，迅速摘眼球取血于1.5 mL EP管中，分离血清。微板法测定血清中AST和ALT的水平。小鼠取血后，立即剖腹取肝脏，于生理盐水中漂洗，用滤纸吸去表面液体，称重。计算肝重指数(liver weight index，LI)，LI/%=肝重/体重×100%。
2.2.4 肝脏病理形态观察肝脏称重后，于小鼠肝脏右叶切取1 mm3组织块，用体积分数为0.025戊二醛溶液固定12 h，磷酸缓冲液冲洗8 h，体积分数为0.01锇酸中浸泡2 h，冲洗脱水后使用Epon812包埋，切片(70 nm)，使用枸橼酸铅染色，透射电镜观察、拍照。
切取适宜大小肝脏右叶于体积分数为0.04多聚甲醛中固定72 h，修块置于包埋盒中，纯水冲洗8 h，常规石蜡包埋处理(软、硬蜡比例为1:3)，4 μm厚切片。于65℃烤片2 h，进行常规HE染色；按照说明书步骤进行Masson染色。光镜下观察db/db小鼠肝脏形态结构变化。
2.2.5 免疫组织化学法测定肝组织GLUT4蛋白的表达将肝脏组织石蜡切片脱蜡水化，EDTA高压加热煮沸修复抗原，PBS洗净，封闭血清，一抗GLUT4以1:200稀释覆盖组织切片，置于冰箱中4℃过夜，PBS冲洗后滴加二抗，置于37℃恒温箱中孵育，冲洗后，DAB试剂显色50 s，苏木精复染细胞核1 min。改用PBS代替一抗，其他实验条件相同进行上述实验设为阴性对照组。光镜下可见阳性信号呈棕黄色，观察GLUT4蛋白表达及分布，并应用Image-Pro Plus 6.0软件测定平均积分吸光度。
2.2.6 Western blot检测IR和IRS-2蛋白表达冰上切取冻存肝脏组织约30 mg，加300 μL RIPA裂解液，低温高速匀浆3次，冰上裂解2 h，4℃离心吸取上清2次，BCA蛋白定量，调整蛋白浓度为5 g·L-1。样品中加入5×loading buffer，沸水浴变性，上样量20 μL。配制12%分离胶用于IRS2(137 ku)的检测，配制8%分离胶用于IR(30 ku)的检测，配制5%浓缩胶。电泳、转膜后，5%脱脂奶粉封闭；加入一抗(IR 1:1 000，IRS-2 1:1 000)4℃摇床过夜，TBST洗涤3次；加入二抗(1:5 000)室温孵育2 h，TBST洗涤3次；吸取显影液(1:1)200 μL均匀涂在膜上，置于自动显影仪中显影。应用Image J软件测定IR、IRS-2与β-actin显影条带的灰度值，内参为β-actin。
2.3 统计学方法应用SPSS 19.0进行统计学分析，实验数据以x±s表示，各组间采用单因素方差分析。
3 结果 3.1 DCI对db/db小鼠一般表征的影响NCG组小鼠精神状态良好、活泼好动、反应敏捷、毛发光亮；MCG组小鼠精神萎靡、动作迟缓、毛发稀疏无光泽、多饮、多食、多尿；高、低剂量DCI干预组小鼠上诉一般表征有不同程度的改善，HDCI改善更明显。
3.2 DCI对db/db小鼠血糖的影响 3.2.1 DCI首次给药对db/db小鼠血糖的影响首次给予DCI后禁食，观察小鼠血糖动态变化见Tab 1，NCG组禁食4 h血糖无明显变化，MCG、HDCI、LDCI组各点血糖值明显高于NCG组(P < 0.01)；与MCG组相比，高、低剂量DCI给药后各时间点血糖值均有不同程度降低，LDCI组与MCG组相比无明显差异(P>0.05)，HDCI组血糖下降明显(P < 0.01)；高、低剂量给药组进行比较，给药后1、2、4 h存在明显差异(P < 0.01)，高剂量DCI组血糖值下降更明显。
| Group | 0 h | 1 h | 2 h | 4 h |
| NCG | 6.49±0.30 | 6.56±0.36 | 6.48±0.46 | 5.42±0.44 |
| MCG | 18.65±2.33** | 18.08±2.87** | 15.75±3.17** | 14.56±3.47** |
| HDCI | 18.58±2.52** | 14.29±2.28**## | 10.83±2.72**## | 9.32±2.05**## |
| LDCI | 18.76±2.08** | 17.61±2.73**△△ | 14.20±2.37**△△ | 13.24±1.81**△△ |
| **P < 0.01 vs NCG; ##P < 0.01 vs MCG; △△P < 0.01 vs HDCI | ||||
DCI对db/db小鼠随机血糖的动态变化见Tab 2，给药6周内NCG组随机血糖无变化，MCG组随机血糖明显高于NCG组(P < 0.01)，且第6周最高；与MCG组相比，LDCI组和HDCI组随机血糖不同程度地下降(P < 0.01)，其中给药第4周降低幅度最大。HDCI组随机血糖值与LDCI组比较没有明显差异(P>0.05)。
| Group | 0 wk | 2 wks | 4 wks | 6 wks |
| NCG | 6.49±0.58 | 6.60±0.46 | 6.48±0.36 | 6.44±0.50 |
| MCG | 18.88±2.87** | 17.57±3.44** | 18.20±2.88** | 20.30±3.38** |
| HDCI | 18.19±2.21** | 13.31±2.37**## | 13.11±3.06**## | 13.69±2.88**## |
| LDCI | 18.50±2.73** | 15.06±3.16** | 14.45±2.10**## | 14.60±1.79**## |
| **P < 0.01 vs NCG; ##P < 0.01 vs MCG | ||||
Tab 3结果显示，MCG组小鼠血清AST活性高于NCG组(P < 0.05)；高、低剂量DCI对血清AST有不同程度降低作用，但与NCG、MCG组相比，均无统计学差异(P>0.05)。各组db/db小鼠血清ALT活性明显较db/m小鼠升高(P < 0.01)；HDCI与LDCI组血清ALT值有降低趋势，但与MCG组比较差异无显著性(P>0.05)。各组db/db小鼠LI值明显高于db/m小鼠(P < 0.01)，LDCI和HDCI组LI值较MCG组略有升高(P>0.05)。
| Group | AST/U·L-1 | ALT/U·L-1 | LI/% |
| NCG | 155.32±24.38 | 76.47±26.16 | 0.041±0.005 |
| MCG | 184.56±22.17* | 129.47±30.41** | 0.062±0.004** |
| HDCI | 176.73±41.46 | 111.64±26.78** | 0.065±0.007** |
| LDCI | 180.25±35.68 | 117.35±27.64** | 0.066±0.006** |
| *P < 0.05, **P < 0.01 vs NCG | |||
Fig 1A的HE染色结果显示，各组小鼠肝组织细胞核被染成蓝色，肝细胞质被染成粉红色。NCG组小鼠肝细胞形态结构正常，胞质染色均匀，未出现水肿，肝小叶清晰，未出现脂肪变性；MCG组小鼠肝细胞条索状排列基本消失，肝细胞明显肿胀变形，有部分肝细胞发生溶解性坏死，可见有炎细胞大量聚集，肝血窦狭窄或闭锁，大量肝细胞脂肪变性，形成脂滴空泡；与MCG组相比，HDCI组、LDCI组小鼠肝脏的病理变化明显减轻，肝细胞基本呈条索状排列，脂滴空泡有所减少。HDCI组小鼠肝组织损伤减轻更明显。
|
| Fig 1 Morphological structure of hepatic tissues in db/db mice A: HE staining; B: Masson staining; C: Electronic microscope |
Fig 1B的Masson染色结果显示，NCG组小鼠肝组织只在门静脉处见少许蓝染物质，MCG组则出现明显的蓝色胶原纤维，主要分布在血管、汇管区及Disse间隙；LDCI组与HDCI组蓝染胶原纤维较MCG组明显减少。
Fig 1C的透射电镜结果显示，NCG组小鼠肝细胞质中内质网、高尔基体等细胞器形态正常，结构清晰，线粒体丰富；MCG组小鼠肝细胞内质网断裂，线粒体减少、变形，正常结构几乎消失，可见散在脂滴和大量胶原纤维；HDCI组和LDCI组较MCG组肝细胞器形态结构明显改善，少见胶原纤维。
3.4 DCI对db/db小鼠肝脏组织中GLUT4、IR和IRS2蛋白表达的影响 3.4.1 免疫组化法检测GLUT4蛋白表达如Fig 2所示，NCG组小鼠肝脏组织细胞质和细胞膜上出现大量的棕黄色染色，且分布均匀，为高表达，细胞核内未见阳性表达。MCG组小鼠肝脏细胞中GLUT4蛋白表达程度偏低，可见少许棕黄色颗粒分布。HDCI组与LDCI组GLUT4的表达明显高于MCG组，棕黄色阳性染色大面积分布，且表达均匀，但HDCI组染色切片总体颜色要深于LDCI组。计算GLUT4阳性表达百分比结果表明，MCG组GLUT4的蛋白表达明显低于NCG组(P < 0.01)；HDCI组的GLUT4表达明显高于MCG组(P < 0.01)；HDCI组的表达最高，与NCG组结果相近(P>0.05)；HDCI组明显高于LDCI组(P < 0.01)。
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| Fig 2 Immunohistochemistry of GLUT4 protein expression in hepatic tissues of db/db mice(x±s, n=10) **P < 0.01 vs NCG; ##P < 0.01 vs MCG; △△P < 0.01 vs HDCI |
如Fig 3所示，MCG组IR表达明显低于NCG组(P < 0.01)；高剂量DCI组IR蛋白表达水平明显高于模型组、NCG组和LDCI组(P < 0.01)；低剂量DCI组与MCG组比较结果相近(P>0.05)。MCG组IRS2蛋白表达低于NCG组(P < 0.01)；高剂量DCI组表达水平与MCG组比较明显升高(P < 0.01)，与NCG组表达结果相近(P>0.05)；低剂量DCI组IRS2的表达水平高于MCG组和NCG组(P < 0.01)，与HDCI组表达结果无差异(P>0.05)。
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| Fig 3 Western blot of IR and IRS2 in hepatic tissues of db/db mice(x±s, n=10) *P < 0.05, **P < 0.01 vs NCG; #P < 0.05, ##P < 0.01 vs MCG; △P < 0.05, △△P < 0.01 vs HDCI |
2型糖尿病严重危害人类健康，该病可致多种器官的损伤，尤以肝损伤更为明显，长期高血糖能发展成为各种肝脏的并发症[8]。db/db小鼠是国际公认的自发2型糖尿病动物模型，具有典型的高血糖、肥胖和肝、肾等器官损伤的特点[9]，该小鼠瘦素受体基因自然突变而缺陷，4周龄开始出现血糖升高和肥胖，早期肝就可出现脂肪性病变，随着时间推移肝脏逐渐向纤维化、肝硬化发展[10]。
本文应用db/db小鼠动物模型，观察了DCI口服给药对db/db小鼠血糖和肝损伤的影响，并探讨其可能机制。结果表明，DCI首次给药1 h就能明显降低db/db小鼠血糖，连续给药6周能持续降低随机血糖，高剂量DCI降血糖作用更明显。说明DCI降糖作用起效较快、持续时间长，进一步证明了DCI有较好的降低血糖作用。通过观察血清AST、ALT、肝重指数及肝脏组织形态结构的变化，考察DCI对糖尿病肝损伤的影响情况。结果显示，DCI对db/db小鼠血清AST和ALT有一定的降低作用，但无统计学差异，是由于实验后期模型组小鼠肝损伤已经非常严重，大部分肝细胞已经发生脂肪变性坏死，产生AST和ALT明显减少，所以给药组与模型组比较无明显差异；肝重指数给药组略高于模型对照组(无统计学差异)，是由于模型组体质量较高，所以肝重指数有一定程度升高，但DCI是否有一定的抑制脂肪生成作用，有待深入研究。从光镜和电镜观察可见，DCI可减轻肝组织的脂肪变性、纤维化程度、炎症细胞浸润及细胞内线粒体和内质网等细胞器的损伤，缓解了db/db小鼠肝脏损伤的进展程度。应用免疫印迹和免疫组化法进一步探究了DCI的作用机制，通过测定肝组织IR、IRS2、GLUT4的蛋白表达发现，DCI可不同程度上调IR、IRS2和GLUT4蛋白的表达，HDCI组表达上调更明显。说明DCI是通过影响IR、IRS2及GLUT4的表达，在胰岛素信号转导通路中发挥积极作用，从而有效缓解胰岛素抵抗，降低血糖。
IR是与胰岛素结合的靶蛋白，大量存在于肝脏细胞膜上，激活后促使IRS磷酸化，从而进行下一步的信号转导。研究表明，IR表达的下调会使人体内胰岛素抵抗，IR的过量表达会对糖尿病患者造成低血糖的风险[11]。IRS2是IR下端信号因子，IRS2在促进肝脏糖原合成，以及抑制HGO中具有重要作用[12]。GLUT4是细胞中胰岛素信号转导末端因子，其主要作用为促使胞外葡萄糖的跨膜转运[13]。
DCI在胰岛素转导通路中发挥重要作用。张泽生等[4, 14]报道，人体内缺乏DCI会导致胰岛素抵抗，DCI能有效增加胰岛素抵抗HepG2细胞的葡萄糖消耗量，促进2型糖尿病大鼠糖原的合成，改善胰岛素抵抗。本研究结果也证明了DCI的降糖作用，但从IR、IRS2和GLUT4蛋白表达的角度探究DCI的作用机制，目前未见文献报道。有文献报道，DCI有抗氧化、降低肝脏脂质含量，并能缓解酒精性脂肪肝的作用[15]。本研究首次从胰岛素转导通路为基础，探究DCI对糖尿病肝损伤的保护作用和作用机制，表明DCI对糖尿病肝损伤有明显的抑制作用。
综上所述，DCI具有降低db/db小鼠血糖，抑制胰岛素抵抗，减轻肝脏组织的脂肪变性和抑制肝脏纤维化的作用。推断可能是由于DCI提高了小鼠肝脏组织中的IR、IRS2和GLUT4蛋白的表达，促进葡萄糖的摄取利用，缓解了胰岛素抵抗，降低血糖，从而产生保护肝脏的作用。但DCI的作用机制可能是多靶点多途径，还需要进一步的研究。
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